وقد استخدمت الأورام organoids على نطاق واسع كنموذج سرطان في المختبر لدراسة علم الأحياء الورم. بروتوكولنا توفير إجراء مفصل لعزل, ثقافة, و التلاعب وراثيا أورام المثانة organoids بمثابة أداة حاسمة لدراسة الجوانب المختلفة في علم الأحياء السرطان. باستخدام بروتوكولنا، يمكننا التلاعب وراثياً بـ ورم المثانة للتعبير عن جينات مصلحتنا أو ضربها.
أيضا، مع أسلوبنا زرع العظام، يمكننا إنشاء ورم الأورام الدقيقة السليمة organoids. وسوف يكون إثبات الإجراء يوبين كيم، وهو طالب دراسات عليا من مختبرنا. ابدأ بإنشاء أورام المثانة من ورم المراة.
إضافة ملليلتر واحد من 10 ملليمتر HEPES في DMEM لشظايا الورم و mince الأنسجة مع شفرة حلاقة معقمة. لفك الشظايا في تعليق الخلية، إضافة تسعة ملليلتر من DMEM مع HEPES، الكولاجين نوع واحد واثنين، والحرارة إلى قطع الورم، واحتضان لهم لمدة 1.5 إلى ساعتين في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون على شاكر المدارية. بعد الحضانة، نقل تعليق الخلية إلى أنبوب 50 ملليلتر.
جهاز طرد مركزي الأنبوب في 400 مرة ز لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية وpirpirate عظمى. Resuspend بيليه في خمسة ملليلترات من ACK lysing العازلة واحتضان الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث إلى خمس دقائق لlyse أي خلايا الدم الحمراء. وفي الوقت نفسه، معطف بئر في لوحة 24-جيدا مع 150 ميكرولترات من عامل نمو الجليد الباردة خفض مصفوفة غشاء الطابق السفلي ووضع لوحة في حاضنة لمدة 30 دقيقة.
إضافة 20 ملليلتر من DMEM في أنبوب مع الخلايا وكرر الطرد المركزي. استلهمت من فوق و resuspend بيليه في ملليلتر واحد من 0.25٪ تربسين EDTA و 10 ميكرومولار Y-27632 ديهيدروكلوريد. احتضان الأنبوب لمدة خمس دقائق في حمام مائي 37 درجة مئوية.
ثم تحييد التربسين بإضافة 10 ملليلتر من DMEM مع 10٪ FBS. تصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر على أنبوب جديد 50 ملليلتر لإزالة الحطام غير مهضّم. جهاز طرد مركزي الأنبوب في 400 مرة ز لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية وpirpirate عظمى.
ثم resuspend بيليه مع ملليلتر واحد من DMEM وعد الخلايا مع قياس الهيموسيت. نقل ثلاث إلى أربع مرات 10 إلى الخلايا السرطانية الأربع إلى 1.5 ملليلتر microtube على الجليد والطرد المركزي في 400 مرة ز لمدة ثلاث دقائق في أربع درجات مئوية. إزالة بعناية فائقة و resuspend الخلايا في 500 ميكرولترات من المتوسطة organoid قبل الدفء و 10 ميكرومولار Y-27632.
نقل تعليق الخلية إلى مصفوفة الغشاء المعدة مسبقا المغلفة جيدا ووضع لوحة 24-well مرة أخرى إلى الحاضنة. استبدال المتوسطة كل يومين مع 500 ميكرولترات من المتوسطة organoided مسبقا. تقسيم organoids الورم 12 ساعة قبل تحويل بواسطة فيروس لينتين.
في اليوم التالي، سرعان ما ذوبان فيروس يحتوي على aliquot في حمام الماء 37 درجة مئوية. إضافة الفيروس المذاب إلى 250 ميكرولترات من المتوسطة العضوية مع 10 ميكرومولار Y-27632 وثمانية ميكروغرام لكل ملليلتر من بروميد الهيكسادي ميثرين. استبدال المتوسطة العضوية في لوحة 24-جيدا مع 500 ميكرولتردات من الفيروس التي تحتوي على المتوسطة واحتضان لوحة لمدة 12 إلى 16 ساعة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
لإعداد الأورام organoids المثانة لزرع العظام، إضافة 500 ميكرولترات من الكولاجيناوز إلى المتوسطة organoid في لوحة 24 جيدا. الميّزة مصفوفة غشاء الطابق السفلي والمتوسط صعودا وهبوطا ثم احتضان لوحة لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية. بعد الحضانة، وجمع الخلايا في أنبوب 15 ملليلتر وإضافة خمسة ملليلتر من DMEM قبل الدفء.
ثم الطرد المركزي الأنبوب في 400 مرات ز لمدة ثلاث دقائق في أربع درجات مئوية وpirspirate عظمى. Resuspend بيليه مع ملليلتر واحد من DMEM ونقل الحل إلى طبق بيتري 90 ملليمتر. تحت المجهر، والتقاط 10 إلى 100 organoids الورم مع ماصة P200 وجمعها في microtube على الجليد.
الطرد المركزي microtube وإزالة بعناية فائقة. ثم الحفاظ على بيليه على الجليد حتى الفئران جاهزة لعملية جراحية. قبل زراعة جدار المثانة تحت الماكو، والحفاظ على المحاقن، نصائح ماصة، ومصفوفة غشاء الطابق السفلي على الجليد حتى جاهزة للاستخدام.
بعد أن تم تخدير الماوس، وضعه في وضعية سوبين والحفاظ على التخدير عن طريق استنشاق قناع من isoflurane vaporized 2٪. تطبيق بوديوني اليود مع الشاش العقيمة ومسحه مع 70٪ الإيثانول. إجراء شق عرضية صغيرة في الجلد وجدار العضلات من أسفل البطن الوسطى مع مقص جراحي معقمة.
كشف المثانة من تجويف البطن ودعم ذلك مع مسحة القطن المنقوعة المالحة. Resuspend الكريات العضوية في 80 ميكرولترات من المتوسطة العضوية التي تحتوي على 50٪ عالية التركيز مصفوفة غشاء الطابق السفلي وحقن التعليق في الجانب الأمامي من قبة المثانة باستخدام حقنة الأنسولين. إغلاق شق مع خياطة النايلون 4-0 وتطهير الموقع الجراحي مع اليود povidone والإيثانول 70٪.
السماح للماوس لاسترداد تحت الأشعة تحت الحمراء المشع لمدة 10 إلى 15 دقيقة. ثم مراقبة الماوس مرة أخرى حتى يستعيد وعيه. تم تأسيس الماوس أورام المثانة organoids وزرع لمدة تسعة أيام.
إذا لم تشكل الخلايا السرطانية الأورام العضوية, يحتمل أن قتل خلال خطوة الانفصال والهضم الأنزيمية قد تحتاج إلى تعديل. عرضت الأورام العضوية المثانة إشارات GFP قوية مع عدوى المناعة الفطرية الناجحة. بعد التركيز ، ما مجموعه 250 ميكرولترات من الفيروسات التي تحتوي على وسائل الإعلام كانت كافية لتصيب 30000 خلية ورم واحد على مصفوفة غشاء الطابق السفلي والحفاظ على كفاءة العدوى 90 إلى 100٪.
تم حصاد الأورام ورم المثانة بعد ثلاثة أسابيع من زرع العظام وتحليل الأنسجة من الورم باستخدام H & E تلطيخ. يمكن أن تنمو عمليات زرع العظام من الأورام العضوية الورمية كما أورام المثانة لمدة أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع. بعد هذا الإجراء، يمكن للباحثين إجراء الكيمياء المناعية من الأورام العضوية الناتجة أو تنفيذ كمية RT-PCR للجينات ذات الأهمية.
هذه التجارب يمكن أن تميز أكثر organoids الورم. بروتوكولنا يسمح لنا بالتلاعب الجينات في الخلايا السرطانية بسهولة مقارنة مع نموذج الماوس مع الحفاظ على خصائص الجسم الحي للأورام من أجل دراسة الوظائف المحددة للجينات المختلفة المشاركة في ورمريجنيسيس سرطان المثانة.
