Organoides tumorais têm sido amplamente utilizados como um modelo de câncer in vitro para estudar biologia tumoral. Nosso protocolo fornece um procedimento detalhado para isolar, cultura e manipular geneticamente organoides tumorais da bexiga servindo como uma ferramenta crítica para estudar vários aspectos na biologia do câncer. Usando nosso protocolo, podemos manipular geneticamente os organoides tumorais da bexiga para expressar ou derrubar o gene do nosso interesse.
Além disso, com nosso método de transplante ortotópico, podemos criar um tumor tumor intacto organoides tumorais. Demonstrando o procedimento será Yubin Kim, um estudante de pós-graduação do nosso laboratório. Comece estabelecendo organoides tumorais da bexiga do tumor da bexiga murina.
Adicione um mililitro de 10 mililitros HEPES em DMEM aos fragmentos tumorais e pique o tecido com uma lâmina de barbear esterilizada. Para dissociar os fragmentos na suspensão celular, adicione nove mililitros de DMEM com HEPES, colagenase tipo um e dois, e termolysina nos pedaços do tumor, e incuba-os por 1,5 a duas horas a 37 graus Celsius e 5% dióxido de carbono em um agitador orbital. Após a incubação, transfira a suspensão celular para um tubo de 50 mililitros.
Centrifugar o tubo a 400 vezes g por cinco minutos a quatro graus Celsius e aspirar o supernasal. Resuspenque a pelota em cinco mililitros de tampão de lise ACK e incubar o tubo em temperatura ambiente por três a cinco minutos para lise qualquer glóbulo vermelho. Enquanto isso, cubra um poço em uma placa de 24 poços com 150 microliters de fator de crescimento frio de gelo reduziu a matriz de membrana do porão e coloque a placa em uma incubadora por 30 minutos.
Adicione 20 mililitros de DMEM no tubo com as células e repita a centrifugação. Aspire o supernascer e resuspenja a pelota em um mililitro de 0,25% de trippsina EDTA e 10 micromolar Y-27632 dihidrocriloreto. Incubar o tubo por cinco minutos em um banho de água de 37 graus Celsius.
Em seguida, neutralize a trippsina adicionando 10 mililitros de DMEM com 10% de FBS. Filtre a suspensão celular através de um filtro de célula de 100 micrômetros em um novo tubo de 50 mililitros para remover detritos não digeridos. Centrifugar o tubo a 400 vezes g por cinco minutos a quatro graus Celsius e aspirar o supernasal.
Em seguida, resuspende a pelota com um mililitro de DMEM e conte as células com um hemótmetro. Transfira de três a quatro vezes 10 para as quatro células tumorais para um microtubo de 1,5 mililitro no gelo e centrífuga a 400 vezes g por três minutos a quatro graus Celsius. Remova cuidadosamente o supernascer e resuspenja as células em 500 microliters de meio organoide pré-armado e 10 micromolar Y-27632.
Transfira a suspensão celular para a matriz de membrana previamente preparada revestida bem e coloque a placa de 24 poços de volta na incubadora. Substitua o meio a cada dois dias por 500 microliters de meio organoide pré-armado. Divida os organoides tumorais 12 horas antes da transdução mediada pelo Lentivírus.
No dia seguinte, descongele rapidamente um vírus contendo alíquota em um banho de água de 37 graus Celsius. Adicione o vírus descongelado a 250 microliters de meio organoide com 10 micromolar Y-27632 e oito microgramas por mililitro de brometo hexadimetrino. Substitua o meio organoide na placa de 24 poços por 500 microliters do vírus contendo médio e incubar a placa por 12 a 16 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Para preparar os organoides tumorais da bexiga para transplante ortotópico, adicione 500 microliters de colagenase dispase ao meio organoide na placa de 24 poços. Pipeta a matriz de membrana do porão e o médio para cima e para baixo, em seguida, incubar a placa por 20 minutos a 37 graus Celsius. Após a incubação, colete as células em um tubo de 15 mililitros e adicione cinco mililitros de DMEM pré-armados.
Em seguida, centrifugar o tubo a 400 vezes g por três minutos a quatro graus Celsius e aspirar o supernante. Resuspense a pelota com um mililitro de DMEM e transfira a solução para uma placa de Petri de 90 milímetros. Sob um microscópio, pegue de 10 a 100 organoides tumorais com uma pipeta P200 e colete-os em um microtubo no gelo.
Centrifugar o microtubo e remover cuidadosamente o supernante. Em seguida, mantenha a pelota no gelo até que os ratos estejam prontos para a cirurgia. Antes do transplante de parede da bexiga submucosal, mantenha as seringas, pontas de pipeta e matriz de membrana do porão no gelo até estar pronto para usar.
Depois que o rato for anestesiado, coloque-o em uma posição supina e mantenha a anestesia por inalação de máscara de isoflurane 2%. Aplique iodo povidone com uma gaze estéril e limpe-a com 70% de etanol. Faça uma pequena incisão transversal na pele e parede muscular do abdômen médio inferior com uma tesoura cirúrgica estéril.
Exponha a bexiga da cavidade abdominal e apoie-a com um cotonete encharcado de soro fisiológico. Resuspenque as pelotas organoides em 80 microliters de meio organoide contendo matriz de membrana de porão de 50% de alta concentração e injete a suspensão no aspecto anterior da cúpula da bexiga usando a seringa de insulina. Feche a incisão com uma sutura de nylon 4-0 e desinfete o local cirúrgico com iodo povidone e 70% de etanol.
Deixe o mouse se recuperar sob um irradiador infravermelho por 10 a 15 minutos. Em seguida, monitore o rato novamente até que ele recupere a consciência. Os organoides tumorais da bexiga do rato foram estabelecidos e cultivados por nove dias.
Se as células tumorais não formam organoides tumorais, elas foram potencialmente mortas durante a etapa de dissociação e o tempo de digestão enzimática pode precisar ser ajustado. Os organoides tumorais da bexiga apresentaram fortes sinais de GFP com infecção lentiviral bem sucedida. Após a concentração, um total de 250 microliters de vírus contendo mídia foi suficiente para infectar 30.000 células tumorais únicas na matriz da membrana do porão e manter uma eficiência de infecção de 90 a 100%.
Os alusões ao tumor da bexiga foram colhidos três semanas após o transplante ortotópico e a histologia do tumor foi analisada por meio da coloração de H&E. Transplantes ortotópicos de organoides tumorais podem crescer como tumores de bexiga por duas a três semanas. Após esse procedimento, os pesquisadores podem realizar a imunohistoquímica de organoides tumorais resultantes ou realizar um RT-PCR quantitativo para genes de interesse.
Esses experimentos podem caracterizar ainda mais os organoides tumorais. Nosso protocolo nos permite manipular os genes nas células cancerosas facilmente comparados ao modelo do camundongo, mantendo características in vivo de tumores, a fim de estudar as funções específicas de vários genes envolvidos na tumorigênese do câncer de bexiga.
