Tumororganoide sind weit verbreitet als In-vitro-Krebsmodell verwendet worden, um Tumorbiologie zu studieren. Unser Protokoll bietet ein detailliertes Verfahren zur Isolierung, Kultur und genetischen Manipulation von Blasentumororganoiden, die als kritisches Werkzeug dienen, um verschiedene Aspekte der Krebsbiologie zu untersuchen. Mit unserem Protokoll können wir die Blasentumor-Organoide genetisch manipulieren, um das Gen unseres Interesses auszudrücken oder auszuschalten.
Mit unserer orthotopischen Transplantationsmethode können wir auch einen intakten Tumor MikroumgebungStumor-Organoid erstellen. Demonstriert wird das Verfahren von Yubin Kim, einem Doktoranden unseres Labors. Beginnen Sie mit der Etablierung von Blasentumor-Organoiden aus dem murinen Blasentumor.
Fügen Sie einen Milliliter 10 Millimolar HEPES in DMEM zu den Tumorfragmenten hinzu und zerkleinern Sie das Gewebe mit einer sterilisierten Rasierklinge. Um die Fragmente in die Zellsuspension zu dissoziieren, fügen Sie neun Milliliter DMEM mit HEPES, Kollagenase Typ eins und zwei, und Thermolysin zu den Tumorstücken, und inkubieren Sie sie für 1,5 bis zwei Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid auf einem Orbital-Shaker. Nach der Inkubation die Zellsuspension in ein 50-Milliliter-Rohr übertragen.
Zentrifugieren Sie das Rohr bei 400 mal g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und aspirieren Sie den Überstand. Setzen Sie das Pellet in fünf MilliliterACK-Lysing-Puffer aus und inkubieren Sie das Rohr bei Raumtemperatur für drei bis fünf Minuten, um rote Blutkörperchen zu lysieren. In der Zwischenzeit einen Brunnen in einer 24-Well-Platte mit 150 Mikrolitereiskalten Wachstumsfaktor reduziert Keller Membranmatrix und legen Sie die Platte in einem Inkubator für 30 Minuten.
Fügen Sie 20 Milliliter DMEM mit den Zellen in die Röhre und wiederholen Sie die Zentrifugation. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in einem Milliliter 0,25%Trypsin EDTA und 10 Mikromolar Y-27632 Dihydrochlorid aus. Inkubieren Sie die Röhre für fünf Minuten in einem 37 Grad Celsius Wasserbad.
Dann neutralisieren Sie das Trypsin, indem Sie 10 Milliliter DMEM mit 10%FBS hinzufügen. Filtern Sie die Zellsuspension durch ein 100-Mikrometer-Zellsieb auf einem neuen 50-Milliliter-Rohr, um unverdaute Trümmer zu entfernen. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 400 mal g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und aspirieren Sie den Überstand.
Dann das Pellet mit einem Milliliter DMEM wieder aufhängen und die Zellen mit einem Hämozytometer zählen. Drei- bis viermal 10 auf die vier Tumorzellen auf ein 1,5-Milliliter-Mikrorohr auf Eis übertragen und bei 400 mal g drei Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und setzen Sie die Zellen in 500 Mikrolitern vorgewärmten organoiden Mediums und 10 Mikromolaren Y-27632 wieder aus.
Übertragen Sie die Zellsuspension gut beschichtet in die zuvor vorbereitete Membranmatrix und legen Sie die 24-Well-Platte wieder in den Inkubator. Ersetzen Sie das Medium alle zwei Tage durch 500 Mikroliter vorgewärmtes organoides Medium. Teilen Sie die Tumororganoide 12 Stunden vor der Lentivirus-vermittelten Transduktion.
Am nächsten Tag schnell auftauen ein Virus, das Aliquot in einem 37 Grad Celsius Wasserbad enthält. Fügen Sie das aufgetaute Virus zu 250 Mikroliter Organoidmedium mit 10 Mikromolaren Y-27632 und acht Mikrogramm pro Milliliter Hexadimethrinbromid hinzu. Ersetzen Sie das organoide Medium in der 24-Well-Platte durch 500 Mikroliter des Virus, das Medium enthält, und bebrüten Sie die Platte 12 bis 16 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.
Um die Blasentumor-Organoide für die orthotopische Transplantation vorzubereiten, fügen Sie dem Organoidmedium in der 24-Well-Platte 500 Mikroliter Kollagenasedispase hinzu. Pipette die Kellermembran Matrix und das Medium auf und ab dann inkubieren die Platte für 20 Minuten bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation die Zellen in eine 15-Milliliter-Röhre sammeln und fünf Milliliter vorgewärmtes DMEM hinzufügen.
Dann zentrifugieren Sie das Rohr bei 400 mal g für drei Minuten bei vier Grad Celsius und aspirieren Sie den Überstand. Das Pellet mit einem Milliliter DMEM aussetzen und die Lösung auf eine 90-Millimeter-Petrischale übertragen. Unter dem Mikroskop 10 bis 100 Tumororganoide mit einer P200 Pipette aufnehmen und in einem Mikrorohr auf Eis sammeln.
Zentrifugieren Sie das Mikrorohr und entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Dann halten Sie das Pellet auf Eis, bis die Mäuse für die Operation bereit sind. Vor der submukosalen Blasenwandtransplantation die Spritzen, Pipettenspitzen und Kellermembranmatrix auf Eis halten, bis sie einsatzbereit sind.
Nachdem die Maus anästhesiert wurde, legen Sie sie in eine Supine-Position und halten Sie die Anästhesie durch Maskeninhalation von 2%verdampftem Isofluran. Povidon-Jod mit einer sterilen Gaze auftragen und mit 70% Ethanol abwischen. Machen Sie einen kleinen Querschnitt in der Haut und Muskelwand der unteren Mittellinie Bauch mit sterilen chirurgischen Schere.
Setzen Sie die Blase aus der Bauchhöhle aus und unterstützen Sie sie mit einem kochigen, durchnässten Wattestäbchen. Setzen Sie die Organoidpellets in 80 Mikroliter organoiden Mediums mit 50% hochkonzentrierter Kellermembranmatrix wieder auf und injizieren Sie die Suspension mit der Insulinspritze in den vorderen Aspekt der Blasenkuppel. Schließen Sie den Schnitt mit einer 4-0 Nylon-Nähte und desinfizieren Sie die chirurgische Stelle mit Povidon-Jod und 70%Ethanol.
Lassen Sie die Maus unter einem Infrarot-Bestrahlungskörper für 10 bis 15 Minuten wiederherstellen. Überwachen Sie dann die Maus erneut, bis sie das Bewusstsein wiedererlangt. Mausblase Tumor Organoide wurden etabliert und kultiviert für neun Tage.
Wenn Tumorzellen keine Tumororganoide bilden, wurden sie möglicherweise während des Dissoziationsschritts getötet und die enzymatische Verdauungszeit muss möglicherweise angepasst werden. Blasentumor-Organoide zeigten starke GFP-Signale mit erfolgreicher lentiviraler Infektion. Nach der Konzentration reichten insgesamt 250 Mikroliter virushaltiger Medien aus, um 30.000 einzelne Tumorzellen in der Kellermembranmatrix zu infizieren und eine Infektionseffizienz von 90 bis 100% zu halten.
Blasentumor-Allographen wurden drei Wochen nach orthotopischer Transplantation geerntet und die Histologie des Tumors mittels H&E-Färbung analysiert. Orthotopische Transplantationen von Tumororganoiden können zwei bis drei Wochen lang als Blasentumoren wachsen. Nach diesem Verfahren können Forscher die Immunhistochemie der resultierenden Tumororganoide durchführen oder eine quantitative RT-PCR für Gene von Interesse durchführen.
Diese Experimente können die Tumororganoide weiter charakterisieren. Unser Protokoll ermöglicht es uns, die Gene in Krebszellen leicht im Vergleich zum Mausmodell zu manipulieren und gleichzeitig die In-vivo-Eigenschaften von Tumoren beizubehalten, um die spezifischen Funktionen verschiedener Gene zu untersuchen, die an der Tumorgenese von Blasenkrebs beteiligt sind.
