هذا البروتوكول خطوة بخطوة يوضح كيفية الكشف عن وتوصيف وظيفيا النشاط الأنزيمي من نوع الحلقة E3 ubiquitin ligases، سواء في المختبر وفي بلانتا، من خلال نهج الطفرات الموجهة الموقع. من خلال إدخال طفرة في مجال RING من خلال الطفرات الموجهة من الموقع ، يمكن اختبار المتحولة الناتجة عن E3 ناقصة بالتوازي مع البروتين البري لربط النشاط الأنزيمي مع الوظيفة. يمكن أن يسهم توضيح الأساس الكيميائي الحيوي والميكانيكي للرابطة من نوع E3 في كل مكان في فهمنا لمهمتها البيولوجية في التطوير وإشارات الإجهاد وصيانة التوازن.
مع تعديل طفيف في نظام التعبير في الجسم الحي، يمكن تطبيق هذا البروتوكول لتحليل أي من نوع RING E3 ligase بغض النظر عن أصله. تبدأ من خلال تحديد Cys المحفوظة والأحماض الأمينية له في المجال الدائري وتصميم التمهيديات التي تحمل codon استبدال الفائدة يحيط بها 15 أزواج قاعدة على جانبي موقع الطفرة. ومن الأهمية بمكان لتحديد المجال الدائري بشكل صحيح، ولا سيما بقايا السيستين والهستيدين المحفوظة.
يمكن استخدام أدوات الإنترنت مثل PROSITE للقيام بذلك. استخدام التمهيديات المطفرة في التضخيم PCR لإدخال الطفرة المطلوبة في البلازميد إيواء الجينات من الفائدة، مع التأكد من استخدام بوليميراز الحمض النووي عالية الدقة، مثل بفو. بعد PCR، هضم الحمض النووي الوالدين المشتق من الإشريكية القولونية وشبه الميثيلية عن طريق إضافة ثلاثة ميكرولترات من إنزيم تقييد Dpnl مباشرة إلى تفاعل PCR وتحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين.
تنقية plasmids المطفرة مع مجموعة استخراج الحمض النووي التجارية، و elute الحمض النووي في 50 ميكرولترات من الماء. ثم، تحويل الخلايا DH5-ألفا E.coli المختصة كيميائيا مع 0.5 ميكرولترات من الحمض النووي البلازميد المُمَاجَع المُستعاد وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة. استنساخ البرية من نوع حلقة ومورثات حلقة تحور من الفائدة في ناقلات pMAL-C2 لدمج هذه الجينات مع علامة epitope MBP.
ثم قم بإعداد تفاعل في كل مكان في الجسم في حجم إجمالي 30 ميكرولترتر، كما هو موضح في المخطوطة، واحتضان الخليط عند 30 درجة مئوية لمدة ساعتين. إنهاء التفاعل عن طريق خلط العينة مع 7.5 ميكرولترات من 5x SDS-PAGE تحميل العازلة وغليانه لمدة خمس دقائق، ثم فصل البروتينات مع 7.5٪ SDS-polyacrylamide هلام الكهرباء. نقل إلى غشاء PVDF، والكشف عن كل مكان مع النشاف الغربية ومكافحة العلم.
وصمة عار الغشاء مع Coomassie الأزرق للتحقق من التحميل على قدم المساواة من اختبار MBP-RING من نوع البروتين. خطط سلالات tumefaciens البكتيريا الزراعية التي تحمل الجين الموسومة epitope من الفائدة على متوسطة LB تحتوي على المضادات الحيوية الاختيار المناسب. بعد يومين من النمو في 28 درجة مئوية، واختيار مستعمرات واحدة، وتنمو في المتوسط LB السائل مع المضادات الحيوية في 28 درجة مئوية و 250 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة أخرى.
نقل 100 ميكرولترات من ثقافة البكتيريا الزراعية إلى ثلاثة ملليلتر من LB الطازجة مع المضادات الحيوية، واحتضان الثقافة لمدة أربع إلى ست ساعات إضافية. تدور أسفل الخلايا في 1, 800 مرات ز لمدة ست دقائق, تجاهل supernatant, و resuspend الخلايا مع ثلاثة ملليلتر من غسل العازلة. كرر غسل مرتين، ثم إعادة تعليق الخلايا في العازلة التعريفي، واحتضان لهم لمدة 10 إلى 12 ساعة إضافية في 28 درجة مئوية.
بعد الحضانة، الطرد المركزي الخلايا في 1، 800 مرات ز لمدة ست دقائق، والتخلص من السوبر. resuspend الخلايا مع مليلترين من حاجز التسلل، وتحديد تركيز البكتيريا باستخدام قيمة OD600. Agroinfiltrate أربعة أسابيع نيكوتيانا benthamiana يترك عن طريق وخز بلطف لهم إبرة، واليد حقن Agrobacterium مع حقنة، ثم دائرة المنطقة المتسللة مع علامة.
بعد 36 ساعة، وجمع الأنسجة ورقة مخترق، وطحنه إلى مسحوق ناعم مع النيتروجين السائل. Resuspend مسحوق الأنسجة مع 300 ميكرولترات من البروتين استخراج العازلة، والطرد المركزي في 15، 000 مرات ز لمدة 15 دقيقة في أربع درجات مئوية. نقل supernatant إلى أنبوب جديد، إضافة 5x SDS-PAGE العازلة تحميل إلى تركيز النهائي من 1x، وغلي العينة لمدة خمس دقائق.
ثم، إجراء تحليل لطخة الغربية للكشف في كل مكان النبات. خط المناسبة سلالات الكومبترياوم tumefaciens تحمل الجينات الموسومة من الفائدة أو ناقلات فارغة، وحقن البكتيريا الزراعية على أوراق نيكوتيانا بنثاميانا، كما هو موضح سابقا. بالنسبة لتدهور البروتين الركيزة المعتمد على E3، اتبع البروتوكول الموصوف سابقًا، وأعمل على النشاف الغربي مع الأجسام المضادة المناسبة للكشف عن تراكم البروتين في الخلايا النباتية.
بالنسبة لتثبيط موت الخلايا الذي يعتمد على E3 بوساطة الاستجابة، راقب الأوراق الزراعية المرشحة لأعراض موت الخلايا من يومين إلى أربعة أيام بعد التسلل. وهناك نموذجي في كل مكان في المختبر نتائج اختبار يحتوي على مسحة متعددة النطاقات بدءا من الوزن الجزيئي للبروتين اختبار والتقدم صعودا. وكما هو متوقع، فإن الضوابط السلبية التي تفتقد المكونات الفردية أو باستخدام MBP لم تثبت الإشارة الملطخة.
وعلاوة على ذلك، فإن تلطيخ Coomassie الأزرق لغشاء PVDF أظهر تحميلًا متساويًا من MBP-RHA1B أو MBP في جميع عناصر التحكم. تم اختبار 11 E2s مختلفة للتحقيق في كيفية في كل مكان في المختبر يختلف تبعاً لمزيج E2 إلى E3 محددة. وتراوح نشاط الانتشار في كل مكان المكتشف من عدم وجود إشارة إلى مسحة متعددة النطاقات تبدأ من أوزان جزيئية مختلفة، مما يشير إلى أنماط مختلفة من كل مكان.
تم اختبار الإصدارات RING-و K-mutant من RHA1B في كل مكان في المختبر وفي بلانتا. ويدعم عدم وجود نشاط الأنزيمية من إصدار حلقة متحولة من عدم قدرته على توليد إما مسحة متعددة الأطراف في المختبر أو تعزيز إشارة تعدد في كل مكان في بلانتا. على الرغم من أنه تم الكشف عن إشارة هامشية في كل مكان ذاتي في المختبر لمتحول K ، تم اكتشاف فقط في كل مكان الخلفية في بلانتا ، مما يشير إلى أن بقايا K146 ضرورية أيضًا لنشاط E3.
على عكس RHA1B البرية من النوع ، فإن متحولة RING التي تفتقر إلى نشاط اللولب E3 لم تتداخل مع موت خلايا الاستجابة المفرطة الحساسية. وأكد النشاف الغربية أن Gpa2 لم تتراكم في وجود البرية من النوع RHA1B، ولكن متحولة حلقة لم يكن لها أي تأثير على استقرار البروتين. وبالنظر إلى أن السليم E2-E3 الجمع ضروري لتفاعل في كل مكان، في المختبر في كل مكان وينبغي أن يتم في مقايسات في كل مكان بالتوازي مع إنزيمات E2 متعددة تمثل فئات E2 مختلفة لتجنب نتائج سلبية كاذبة.
وE3- حروف مزدوجة ناقصة يُسهل اختبار التفاعلات الإنزيمات الركيزة في الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، هذا المتحولة غالبا ما يعطي النمط الظاهري السلبية السائدة التي يمكن استخدامها في دراسات خروج المغلوب الوظيفية كنهج بديل لRNAi. باستخدام هذا البروتوكول، وقد تبين مؤخرا أن تأثير RHA1B الخيطية تتداخل مع إشارة المناعة النباتية بطريقة تعتمد على E3 من خلال استهداف مُستقبِل المُنَزَه Gpa2 للنبات في كل مكان والتحلل.
