このステップバイステップのプロトコルは、部位指向の変異誘発アプローチを通じて、in vitroおよびplantaの両方で、RING型E3ユビキチンリガースの酵素活性を検出し、機能的に特徴付ける方法を示しています。部位特異的突然変異誘発を介してRINGドメインに変異を導入することにより、得られたE3欠損変異体を野生型タンパク質と並行して試験し、酵素活性を機能性と結び付けることができる。RING型E3ユビキチンリガーゼの生化学的・機械的基盤を解明することは、ホメオスタシスの発生、ストレスシグナル伝達、維持における生物学的意義の理解に大きく貢献します。
in vivo発現システムのわずかな変更により、このプロトコルは、その起源に関係なく、任意のRING型E3リガーゼの分析に適用することができる。まず、RINGドメイン中の保存されたCysおよびHisアミノ酸を同定し、突然変異部位の両側に15塩基対で隣接する目的の置換コドンを運ぶプライマーを設計する。RINGドメイン、特にその保存されたシステインおよびヒスチジン残基を適切に同定することが重要である。
PROSITEなどのオンラインツールを使用できます。PCR増幅に変異原性プライマーを使用して、目的の遺伝子を収容するプラスミドに所望の変異を導入し、Pfuなどの高忠実度DNAポリメラーゼを使用することを確認します。PCR後、Dpnl制限酵素の3マイクロリットルをPCR反応に直接加え、摂氏37度で2時間インキュベートすることにより、大腸菌由来の親メチル化および半メチル化DNAを消化します。
市販のDNA抽出キットで変異原性プラスミドを精製し、50マイクロリットルの水でDNAを溶出させます。次に、DH5-α大腸菌を、製造業者のプロトコルに従って、回収された変異原性プラスミドDNAの0.5マイクロリットルで化学的に有能な細胞を変換する。野生型のRINGと変異したリング遺伝子をpMAL-c2ベクターにクローン化し、これらの遺伝子をMBPエピトープタグと融合します。
次に、原稿に記載されているように、全容量30マイクロリットルのインビトロユビキチン化反応をセットアップし、2時間摂氏30度で混合物をインキュベートする。5x SDS-PAGEローディングバッファーの7.5マイクロリットルでサンプルを混合し、5分間沸騰させることによって反応を終了し、その後、7.5%SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動でタンパク質を分離します。PVDF膜上に移し、ウェスタンブロッティングとアンチフラグでユビキチン化を検出します。
プマシーブルーで膜を染色し、試験したMBP-RING型タンパク質の等しい負荷を確認します。アグロバクテリウム・トゥメファシエンス株は、適切な選択抗生物質を含むLB培地上の目的のエピトープタグ付き遺伝子を運ぶ株をストリークする。摂氏28度で2日間成長した後、単一のコロニーを選び、さらに28°Cの抗生物質と250 rpmのLB液体培地で成長させます。
100マイクロリットルの農薬培養液を抗生物質で新鮮なLBの3ミリリットルに移し、さらに4〜6時間培養をインキュベートする。1,800回gで細胞を6分間回転させ、上清を捨て、3ミリリットルの洗浄バッファーで細胞を再懸濁します。洗浄を2回繰り返し、誘導バッファー内の細胞を再懸濁し、さらに摂氏28度で10〜12時間インキュベートします。
インキュベーション後、細胞を1、800回gで6分間遠心し、上清を捨てる。2ミリリットルの浸潤バッファーで細胞を再懸濁し、OD600値を用いて細菌の濃度を決定する。4週間齢のニコチアナ・ベンタミアナの葉を針で軽く刺して浸潤し、注射器でアグロバクテリウムを手注入し、浸潤した領域をマーカーで囲む。
36時間後、浸潤した葉組織を回収し、液体窒素で微粉末状に粉砕する。300マイクロリットルのタンパク質抽出バッファーで組織粉末を再懸濁し、摂氏4度で15,000倍gで遠心分離します。上清を新しいチューブに移し、5倍のSDS-PAGEローディングバッファを最終濃度の1倍に加え、サンプルを5分間沸騰させます。
次いで、ウェスタンブロット分析を行い、プランタユビキチン化を検出する。適切なアグロバクテリウム・トゥメファシエンス株は、目的のタグ付き遺伝子または空のベクターを運び、ニコティアナベンタミアナの葉にアグロバクテリウムを注入し、前述のように。E3依存性基質タンパク質分解については、前述のプロトコルに従い、植物細胞におけるタンパク質蓄積を検出するために適切な抗体を用いてウェスタンブロットを行う。
E3依存性過敏応答媒介細胞死阻害の場合、浸潤後2~4日の細胞死症状に対する農浸潤葉を監視する。典型的なインビトロユビキチン化アッセイの結果は、試験されたタンパク質の分子量から始まり、上向きに進行するマルチバンドスミアを含む。予想通り、負のコントロールは、個々のコンポーネントが欠落しているか、MBPを使用して、スミア信号を実証しませんでした。
さらに、PVDF膜のクマシーブルー染色は、すべての制御においてMBP-RHA1BまたはMBPの等しい負荷を示した。11種類のE2sを試験し、特定のE2からE3の組み合わせに応じてインビトロユビキチン化がどのように変化するかを調べた。検出されたユビキチン化活性は、シグナルなしから異なる分子量から始まるマルチバンドスミアにまで、異なるユビキチン化パターンを示す。
RHA1BのリングおよびK変異型バージョンを、インビトロおよびプランタでユビキチン化について試験した。RING変異型バージョンの酵素活性の欠如は、インビトロでマルチバンドスミアを生成するか、プランタでポリユビキチン化シグナルを促進することができないことに支えられている。K変異体に対してインビトロで限界自己ユビキチン化シグナルが検出されたが、植物の中では背景ユビキチン化のみが検出され、K146残基もE3活性に必須であることを示唆している。
野生型RHA1Bとは異なり、E3リガーゼ活性を欠いたRING変異体は、過敏応答細胞死を妨げなかった。ウエスタンブロッティングは、Gpa2が野生型RHA1Bの存在下で蓄積しないことを確認したが、RING変異体はタンパク質の安定性に影響を与えなかった。ユビキチン化反応には適切なE2-E3の組み合わせが必要であることを考えると、インビトロユビキチン化アッセイは、偽陰性の結果を避けるために、異なるE2クラスを表す複数のE2酵素と並行して行われるべきである。
E3リガーゼ欠損変異体は、生体内での酵素基質相互作用の試験を容易にする。さらに、この変異体は、RNAiの代替アプローチとして機能的ノックアウト研究で利用できる優性負表現型を与えることが多い。このプロトコルを用いて、RHA1B線虫エフェクターは、ユビキチン化および分解のために植物Gpa2免疫受容体を標的とすることにより、E3依存的に植物免疫シグナル伝達を妨害することが最近発見された。
