이 단계별 프로토콜은 현장 지향 돌연변이 발생 접근법을 통해 시험관 내 및 질경이 모두에서 RING 형 E3 유비퀴틴 리게스의 효소 활성을 감지하고 기능적으로 특성화하는 방법을 보여줍니다. 사이트 지향 돌연변이 발생을 통해 링 도메인에 돌연변이를 도입함으로써, 생성된 E3-결핍 돌연변이는 효소 활성을 기능성과 연결하기 위해 야생형 단백질과 병행하여 테스트할 수 있다. RING 형 E3 유비퀴틴 리갈아제의 생화학적 및 기계적 기초를 해명하면 항상성의 발달, 스트레스 신호 및 유지 보수에서 생물학적 중요성에 대한 우리의 이해에 크게 기여할 수 있습니다.
생체 내 발현 시스템을 약간 변형하면 이 프로토콜은 원점에서 관계없이 모든 링형 E3 리개제 분석에 적용할 수 있습니다. 링 도메인에서 보존된 Cys와 그의 아미노산을 식별하고 돌연변이 부위의 양쪽에 15개의 기본 쌍이 측면으로 둘러싸인 관심의 대체 코동을 운반하는 프라이머를 설계하는 것으로 시작합니다. 링 도메인, 특히 보존된 시스테인과 히스티딘 잔류물을 제대로 식별하는 것이 중요합니다.
PROSITE와 같은 온라인 도구를 사용하여 사용할 수 있습니다. PCR 증폭에서 돌연변이 프라이머를 사용하여 관심 유전자를 품고 있는 플라스미드내로 원하는 돌연변이를 도입하여 Pfu와 같은 고충실도 DNA 폴리머라아제를 사용해야 합니다. PCR 후, PcR 반응에 Dpnl 제한 효소의 3마이크로리터를 직접 추가하고 2시간 동안 섭씨 37도에서 배양하여 대장균 유래 부모 메틸화 및 반 메틸화 DNA를 소화한다.
상용 DNA 추출 키트로 돌연변이 된 플라스미드를 정화하고 50 마이크로 리터의 물에서 DNA를 엘로트하십시오. 이어서, 제조자의 프로토콜에 따라 회수된 돌연변이 플라스미드 DNA의 0.5 마이크로리터로 DH5-알파 E.coli의 화학적으로 유능한 세포를 변형시킨다. 이러한 유전자를 MBP 에피토프 태그와 융합하기 위해 pMAL-c2 벡터로 관심있는 야생 형 링 및 돌연변이 링 유전자를 복제합니다.
이어서, 원고에 설명된 바와 같이 총 30마이크로리터의 체외 유비쿼터티화 반응을 설정하고, 2시간 동안 30°C로 혼합물을 배양한다. 5x SDS-PAGE 로딩 버퍼의 7.5 마이크로리터와 샘플을 혼합한 다음 5분 동안 끓인 다음 단백질을 7.5%SDS-polyacrylamide 젤 전기포고증으로 분리하여 반응을 종료합니다. PVDF 멤브레인으로 이송하고, 서쪽 블로팅 및 안티 플래그로 유비쿼터티를 감지합니다.
Coomassie 블루로 멤브레인을 얼룩지게하여 테스트 된 MBP-링 형 단백질의 동일한 하중을 확인합니다. 적절한 선택 항생제를 포함하는 LB 배지에 대한 관심의 에피토프 태그 유전자를 운반하는 Agrobacterium tumefaciens 균주를 줄무늬. 섭씨 28도에서 2일 간의 성장 후, 단일 식민지를 선택하고, 28°C에서 항생제를 가진 LB 액체 배지에서 24시간 동안 250rpm으로 성장합니다.
농균 배양100마이크로리터를 항생제로 신선한 LB 의 3밀리리터로 옮기고, 4~6시간 동안 배양한다. 6 분 동안 1, 800 배 g에서 세포를 회전, 슈퍼 나탄을 폐기하고 세척 버퍼의 세 밀리리터로 세포를 다시 중단. 세척을 두 번 반복한 다음 유도 버퍼에서 세포를 다시 일시 중지한 다음 섭씨 28도에서 10~12시간 동안 추가로 배양합니다.
인큐베이션 후, 세포를 1, 800배 g에서 6분간 원심분리하고, 상체를 폐기한다. 침투 완충제의 2 밀리리터로 세포를 재중단하고 OD600 값을 사용하여 박테리아의 농도를 결정합니다. 농병침 4주된 니코티아나 벤타미안나는 바늘로 부드럽게 찌르고, 주사기로 아그로박테리움을 직접 주입한 다음, 침입자 부위를 마커로 동그라미로 만듭니다.
36 시간 후에, 침투된 잎 조직을 수집하고 액체 질소를 가진 미세 한 분말로 갈기. 300 마이크로리터의 단백질 추출 완충제로 조직 분말을 다시 중단하고, 섭씨 4도에서 15분 동안 15, 000배 g의 원심분리기. 상체를 신선한 튜브로 옮기고, 5배 SDS-PAGE 로딩 버퍼를 최종 농도1x에 추가하고, 샘플을 5분간 끓입니다.
그런 다음, 질경이 유비퀴티니션에서 검출하기 위해 서부 블롯 분석을 수행한다. 관심 또는 빈 벡터의 태그 유전자를 운반하는 적절한 Agrobacterium tumefaciens 균주를 줄이, 니코티아나 벤타미안 잎에 Agrobacterium을 주입, 이전에 설명된 바와 같이. E3 의존기질 단백질 분해를 위해, 이전에 설명된 프로토콜을 따르고, 적절한 항체로 서양 블로팅을 수행하여 식물 세포에서 단백질 축적을 검출한다.
E3 의존과민반응-매개세포사멸 억제의 경우, 2~4일 후 세포사 증상에 대한 농구침잎을 모니터링한다. 전형적인 체외 유비퀴티닝 분석 결과는 테스트된 단백질의 분자량에서 시작하여 위쪽으로 진행되는 다중 대역 얼룩을 포함합니다. 예상대로 개별 구성 요소가 누락되거나 MBP를 사용하는 음수 제어는 얼룩신호를 보여주지 않았습니다.
더욱이, PVDF 멤브레인의 쿠마시 블루 염색은 모든 컨트롤에서 MBP-RHA1B 또는 MBP의 동등한 로딩을 보였다. 11개의 다른 E2s는 특정 E2에서 E3 조합에 따라 시험관 내 보편화가 어떻게 변하는지 조사하기 위해 시험되었다. 검출된 유비퀴티닝 활동은 신호 없음에서 다른 분자량에서 시작되는 다중 대역 얼룩까지 다양하여 다른 유비쿼터티닝 패턴을 나타냅니다.
RHA1B의 링 및 K 돌연변이 버전은 시험관 내 및 질경이에서 유비퀴티니션을 테스트했습니다. 링 돌연변이 버전의 효소 활성부족은 체외에서 다중 대역 얼룩을 생성하거나 질에서 다중 유비퀴티션 신호를 촉진할 수 없다는 데 의해 지원됩니다. K 돌연변이체에서 한계자가 유비쿼터티신호가 검출되었지만, 질란에서만 배경 유비쿼터티가 검출되어 K146 잔류물도 E3 활동에 필수적임을 시사한다.
야생형 RHA1B와 달리, E3 리게아제 활성이 결여된 링 돌연변이는 과민반응 세포 사멸을 방해하지 않았다. 서양 블로팅은 Gpa2가 야생 형 RHA1B의 존재에 축적되지 않았음을 확인했지만, 링 돌연변이는 단백질 안정성에 영향을 미치지 않았다. 유비쿼터티네이션 반응에 적합한 E2-E3 조합이 필요하다는 점을 감안할 때, 체외 유비쿼터티션 분석법은 거짓 부정적인 결과를 피하기 위해 다른 E2 클래스를 나타내는 여러 E2 효소와 병행하여 운반되어야 한다.
E3 리구효소 결핍 돌연변이체는 생체 내에서 효소 기질 상호 작용의 테스트를 용이하게 한다. 더욱이, 이 돌연변이는 수시로 RNAi에 대안 접근으로 기능적인 녹아웃 연구 결과에서 이용될 수 있는 지배적인 음성 표현형을 부여합니다. 이 프로토콜을 사용하여, RHA1B 선충 이펙터는 유비퀴티닝 및 분해를 위한 식물 Gpa2 면역 수용체를 표적으로 하여 E3 의존적인 방식으로 식물 면역 신호를 방해한다는 것을 최근에 발견되었습니다.
