此分步协议演示如何通过站点定向诱变方法检测环型 E3 泛素连结酶的酶活性和功能特征。通过通过位点定向突变引入环域中的突变，结果E3缺乏突变可以与野生型蛋白质并行测试，将酶活性与功能联系起来。阐明环型E3泛素连结的生化和机械基础，有助于我们理解它们在发育、压力信号和维持平衡中的生物学意义。
通过对体内表达系统的轻微修改，此协议可应用于任何环型 E3 连体的分析，无论其来源如何。首先识别环域中保存的 Cys 和其氨基酸，并设计带具有利益的替代子的底器，在突变位点两侧由 15 个碱基对组成。正确识别环域至关重要，尤其是其保存的半胱氨酸和组氨酸残留物。
可以使用 PROSITE 等在线工具。使用PCR扩增中的诱变质原生将所需的突变引入含有感兴趣的基因的质粒中，确保使用高保真DNA聚合酶，如Pfu。在PCR之后，通过将三微升的Dpnl限制酶直接加入PCR反应，并在37摄氏度下孵育两小时，消化大肠杆菌衍生的亲甲基化和半甲基化DNA。
使用商业DNA提取试剂盒净化突变质粒，并在50微升水中提取DNA。然后，根据制造商的协议，用0.5微升的回收诱变质粒DNA将DH5-alpha大肠杆菌化学能力细胞进行转化。将野生型环和感兴趣的基因突变到pMAL-c2载体中，用MBP表位标记融合这些基因。
然后，如手稿所述，在总体积为 30 微升的体积中建立体外泛化反应，并在 30 摄氏度下孵育混合物两小时。通过将样品与 5x SDS-PAGE 加载缓冲液的 7.5 微升混合并煮沸 5 分钟，然后用 7.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质来终止反应。转移到PVDF膜上，检测与西印迹和防旗的泛化。
用库马西蓝色染色膜，以验证测试的 MBP-RING 型蛋白质的等量。在含有适当选择抗生素的LB介质上携带感兴趣的表位标记基因的农业细菌tumefaciens菌株。在28摄氏度下生长两天后，选择单菌落，在LB液体介质中生长，在28摄氏度和250转/分的抗生素中再生长24小时。
用抗生素将100微升的农业细菌培养剂转移到3毫升新鲜LB中，再孵育4至6个小时。以1，800倍g旋转细胞6分钟，丢弃上流液，用三毫升洗涤缓冲液重新向细胞增殖。重复洗涤两次，然后在感应缓冲液中重新填充细胞，并在28摄氏度下再孵育10至12小时。
孵育后，将细胞以1，800倍g离心6分钟，然后丢弃上经剂。用两毫升的渗透缓冲液重新填充细胞，并使用OD600值确定细菌的浓度。农业过滤四个星期大的尼科蒂亚娜本thamiana叶轻轻刺他们用针，并用手注射农业细菌与注射器，然后用标记圈渗透区域。
36小时后，收集渗透的叶组织，用液氮研磨成细粉。用300微升的蛋白质提取缓冲液重新填充组织粉末，并在4摄氏度下以15000倍g离心，15分钟。将上流液转移到新鲜管中，将5倍SDS-PAGE加载缓冲液加入1倍的最终浓度，将样品煮沸5分钟。
然后，进行西印分析，以检测植物泛化。如前面所述，将携带标记的感兴趣基因或空载体的农业细菌菌株，注射到尼科蒂亚娜本thamiana叶上。对于E3依赖基底蛋白降解，按照上述方案进行西印，用适当的抗体检测植物细胞中的蛋白质积累。
对于E3依赖性超敏感反应中位细胞死亡抑制，监测农业渗透叶细胞死亡症状2至4天后渗透。典型的体外泛化测定结果包含多波段涂片，从测试蛋白质的分子量开始向上推进。如预期的那样，缺少单个组件或使用 MBP 的负控制没有显示被涂抹的信号。
此外，PVDF膜的库马西蓝色染色显示，在所有控制装置中，MBP-RHA1B或MBP的负载相等。对11种不同的E2进行了测试，以研究体外泛化如何根据特定的E2到E3组合而变化。检测到的泛化活性范围从无信号到从不同分子量开始的多波段涂片，指示不同的泛化模式。
RHA1B的环和K突变版本在体外和植物中进行了泛化测试。RING突变版本的酶活性的缺乏，是因为它无法在体外生成多波段涂片或在植物中促进多泛化信号。虽然在体外检测到K突变体上有边际自泛信号，但仅在植物中检测到背景泛化，这表明K146残留物对E3活性也是必不可少的。
与野生型RHA1B不同，缺乏E3连体活性的环突变体没有干扰超敏感反应细胞死亡。西方印迹证实Gpa2没有在野生型RHA1B的存在中积累，但环突变体对蛋白质稳定性没有影响。鉴于适当的E2-E3组合对于泛化反应是必要的，体外泛化测定应与代表不同E2类的多种E2酶同时进行，以避免假阴性结果。
E3连结缺乏突变体有助于在体内测试酶-基质相互作用。此外，该突变体通常赋予一个显性的负面表型，可用于功能敲除研究作为RNAi的替代方法。利用本协议，最近发现RHA1B线虫效应器通过靶向植物Gpa2免疫受体进行泛化和降解，以E3依赖的方式干扰植物免疫信号。
