يعمل بروتوكول لدينا كأداة للعثور على المركبات التي تمنع إزالة نشاط الغشاء المقيد pyrophosphatase. ويمكن استخدام هذه المثبطات في علاج العديد من الأمراض الطفيلية. هذا البروتوكول هو رخيصة وبسيطة تنتج لون مستقر لفترة طويلة دون أن تظهر أي تدخل في وجود تركيز فوسفوليبيد عالية المطلوبة لإعادة تنشيط الانزيم.
إعداد 10 ملليلترات من محلول العزل إعادة التنشيط، تحتوي على 20 ملليمولار M-E-S في PH 6.5، 3.5٪ حجم من قبل الجلسرين حجم، اثنين من ملليمولار D-T-T، و 0.05٪ D-D-M. إعداد 10 ملليلتر من خلاط التفاعل, تحتوي على 200 ميليمولار ثلاثي هيدروكلوريد في PH ثمانية. ثمانية كلوريد المغنيسيوم ميليمولر، 333 ميليمولار كلوريد البوتاسيوم، و 67 ملليمولار كلوريد الصوديوم.
لتحضير 30 ملليغرام لكل مليلتر ليبوزومات لإعادة تنشيط الإنزيم. أولا، إضافة 10 ملليلتر من 20 ملليمولار من هيدروكلوريد ثلاثية في PH ثمانية، مع واحد ملليمتر D-T-T إلى 0.3 غرام من L ألفا فوسفاتيديلكولين من فول الصويا. وضع liposome على الجليد و sonicate مع واحد بعد فترات ثانية لمدة دقيقة واحدة.
وقفة لمدة دقيقة واحدة، وكرر حتى يصبح الحل أصفر شفاف. Aliquot liposomes في 100 ميكرولتر، وتجميد النيتروجين السائل وتخزينها في درجة مئوية سلبية 80 حتى استخدامها. لإعادة تنشيط الإنزيم، ذوبان محلول الدهون في درجة حرارة الغرفة.
مزيج 40 ميكرولترات من محلول liposome مع 22.5 ميكرولترات من 20٪ D-D-M. حافظ على الخليط عند درجة حرارة 55 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. والسماح لها لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
ثم إضافة 36.5 ميكرولترات من الحل المخزن المؤقت إعادة التنشيط. مزيج. وإضافة ميكرولتر واحد من البروتين المركز لجعل تركيز إجمالي 0.13 ملليغرام لكل ملليلتر. بعد ذلك، نقل 20 ميكرولترات من الانزيم تنشيطها إلى 1480 ميكرولترات من خليط التفاعل.
تخلط بلطف واستخدامها على الفور. أولاً، حل المركبات في D-M-S-O لجعل حلول المخزون من 50 ملليمولار في 200 ميكرولترتر. بالنسبة للمركبات القابلة للذوبان تمييع محلول المخزون بالماء إلى ملليلتر واحد في الأنابيب الدقيقة ، لإعطاء اثنين و 10 و 100 ميكرومولار.
لكل تخفيف، دوامة حل مركب للخلط السليم. بعد ذلك، تحقق من التباعد المركب، واستخدام الأنابيب متعددة القنوات، الاستغناء 75 ميكرولترات من خليط التفاعل في كل بئر في لوحة 96-جيدا. إضافة 75 ميكرولترات من كل مركب والمياه كتحكم في ثلاثية، ومزيج عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا خمس مرات.
قياس كل بئر في 300 فولت باستخدام مقياس الكلية microplate. لإعداد محلول سيترات الزرنينيت ، الوزن خمسة غرامات من زرنينيت الصوديوم وخمسة غرامات من ثيرسيدات الصوديوم ، قم بحل كلا المركبين في 100 ملليلتر من الماء. ثم، إضافة خمسة ملليلتر من حمض الخليك الجليدي.
مزيج، وإضافة الماء إلى 250 ملليلتر، وتخزينها في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء. المقبل، وإعداد الحل A بإضافة 10 ملليلتر من الجليد الباردة 0.5 حمض الهيدروكلوريك المولر إلى 0.3 غرام من حمض الاسكوربيك حل حمض الاسكوربيك عن طريق دوامة. تحضير الحل B بإضافة ملليلتر واحد من الماء البارد الثلج إلى 70 ملليغرام من رباعيات الأمونيوم رباعية هيدروهيدرات، ودوامة إلى حل.
متجر حل A و B على الجليد. لإعداد معيار الفوسفات بتركيز صفري، 62.5 و250 و500 ميكرومولار للمعايرة. إضافة صفر microliters، 12.5 ميكرولترتر، 50 ميكرولترتر، و 100 ميكرولترات من 5 ملليمولار فوسفات الصوديوم ديهيدرات فوسفات الصوديوم إلى أربعة أنابيب صغيرة تحتوي على 370 ميكرولترات من خليط التفاعل.
أعلى ما يصل إلى ملليلتر واحد مع الماء. الآن إضافة ملليلتر واحد من الحل باء إلى 10 ملليلتر من الحل A، مزيج باليد وتخزين الحل على الجليد. باستخدام pipet متعدد القنوات، إضافة 40 ميكرولترات من الصفر، 62.5، 250، و 500 معيار الفوسفات ميكرومولر إلى البرامج النصية أنبوب في ثلاث ية.
ثم إضافة 25 ميكرولترات من حل مركب و 15 ميكرولترات من M-P-P-A خليط حل كل أنبوب. باستثناء الأنابيب التي تحتوي على معيار الفوسفات. ختم شرائط أنبوب مع ورقة لاصقة الختم.
قطع ورقة الختم لفصل كل شريط أنبوب. بعد ذلك، قبل احتضان العينة لمدة خمس دقائق في 71 درجة مئوية. ضع العينة على كتلة التدفئة مع فواصل ثانية 20 بين كل قطاع.
لكل قطاع، فتح لاصق الختم. باستخدام الأنابيب متعددة القنوات، إضافة 100 ميكرولترات من اثنين من الصوديوم الصوديوم دباسيتش بيروفوسفات. ويخلط عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا لمدة خمس مرات.
ختم شريط أنبوب مرة أخرى باستخدام نفس الختم. احتضان مرة أخرى في 71 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، ضع العينات على جهاز التبريد مع فاصل زمني 20 ثانية بين كل قطاع.
السماح لهم يبرد لمدة خمس دقائق ومن ثم الطرد المركزي كل قطاع لفترة وجيزة لdedant قطرات الماء تحت ورقة الختم. وضع الشريط مرة أخرى إلى جهاز التبريد، وإزالة الختم والسماح لهم تبرد لمدة خمس دقائق أخرى. ثم إضافة 60 ميكرولترers من الحل A و B، مزيج عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا لمدة خمس مرات، والحفاظ على شرائط أنبوب على جهاز التبريد لمدة 10 دقائق أخرى.
في غطاء الدخان، إضافة 90 ميكرولترات من محلول سيترات الزرنييت والحفاظ على درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل. لإنتاج لون أزرق مستقر. الاستغناء 180 ميكرولترات من كل خليط تفاعل في واضحة 96 جيدا البوليسترين microplate.
استخدم مقياس طيفي للصفيحة الدقيقة لقياس امتصاص كل بئر عند 860 نانومتر. في هذا البروتوكول، تم اختبار ثمانية مركبات جنبا إلى جنب مع I-D-P، وهو المانع المشترك لفوسفاتاز بيرو كتحكم إيجابي. بعد إضافة حل A و B، و سترات الزرنييت، لون أزرق في 30 دقيقة من الحضانة في درجة حرارة الغرفة.
كل ثلاثة تركيزات من المركبات غير المثبطة، وعرض نفس كثافة اللون الأزرق. وكذلك E-1 إلى E-3 دون أي مثبط. مؤامرة من النشاط الأنزيمي ضد تركيز كل مركب اختبار، ويبين أن المركب مع نشاط تثبيط شكلت منحنى غير خطي المناسب.
المؤامرة من I-D-P كتحكم إيجابي، يظهر بوضوح انخفاض في النشاط في تركيزات أعلى. منحنى تثبيط للمركبات واحد، خمسة، ستة، سبعة، وثمانية. يظهر تركيزات مثبطة نصف قصوى في 1.7 ميكرومولار، 21.4 ميكرومولار، 58.8 ميكرومولار، 239.0 ميكرومولار، وأكبر من 500 ميكرومولار، على التوالي.
تذكر أن تستعد، حل M-P-P-A. قبل بداية الفحص
