Il nostro protocollo funziona come uno strumento per trovare composti che inibiscono la de-attività della pirofosfatasi legata alla membrana. E questi inibitori possono essere utilizzati nel trattamento di diverse malattie parassitarie. Questo protocollo è economico e semplice producendo colori stabili per lungo tempo senza mostrare alcuna interferenza in presenza di alta concentrazione fosfolipidica richiesta per la riattivazione enzimatica.
Preparare 10 millilitri della soluzione tampone di riattivazione, contenenti 20 millimolare M-E-S a PH 6,5, 3,5% volume per glicerolo volume, due D-T-T millimolare e 0,05%D-D-M. Preparare 10 millilitri del miscelatore di reazione, contenenti 200 tris cloridrato di millimolare a PH otto. Cloruro di magnesio millimolare, cloruro di potassio millimolare 333 e cloruro di sodio millimolare da 67 millimolare.
Preparare 30 milligrammi per liposomi millilitro per la riattivazione enzimatica. In primo luogo, aggiungere 10 millilitri di 20 millimolare di tris cloridrato a PH otto, con un D-T-T millimolare a 0,3 grammi di L alfa fosfatidilcolina dal fagiolo di soia. Metti il liposoma sul ghiaccio e sonica con un secondo post-intervalli per un minuto.
Mettere in pausa per un minuto e ripetere fino a quando la soluzione diventa giallo trasparente. Aliquota i liposomi in 100 microlitri, congelare l'azoto liquido e conservare a -80 gradi Celsius fino a quando non viene utilizzato. Per riattivare l'enzima, scongelare la soluzione liposoma a temperatura ambiente.
Mescolare 40 microlitri della soluzione liposoma con 22,5 microlitri del 20%D-D-M. Mantenere la miscela a 55 gradi Celsius per 15 minuti. E lasciare raffreddare a temperatura ambiente.
Quindi, aggiungere 36,5 microlitri della soluzione tampone di riattivazione. Mescolare e aggiungere un microlitro di proteine concentrate per ottenere una concentrazione totale di 0,13 milligrammi per millilitro. Successivamente, trasferire 20 microlitri dell'enzima riattivato a 1480 microlitri della miscela di reazione.
Mescolare delicatamente e utilizzare immediatamente. In primo luogo, sciogliere i composti in D-M-S-O per realizzare soluzioni stock di 50 millimolari in 200 microlitri. Per i composti solubili diluire la soluzione stock con acqua a un millilitro in micro tubi, per dare due, 10 e 100 micromolari.
Per ogni diluizione, vortice la soluzione composta per una corretta miscelazione. Successivamente, controllare la divergenza composta e, utilizzando una pipetta multicanale, erogare 75 microlitri della miscela di reazione in ogni pozzo in una piastra da 96 porri. Aggiungere 75 microlitri di ogni composto e acqua come controllo in triplice copia e mescolare pipettando su e giù cinque volte.
Misurare ogni pozzo a 300 volt utilizzando un nefelometro micropiatta. Per preparare la soluzione di citrato di arsenite, pesare cinque grammi di arsenite di sodio e cinque grammi di diidrato di citrato di trisodico, sciogliere entrambi i composti in 100 millilitri di acqua. Quindi, aggiungere cinque millilitri di acido acetico glaciale.
Mescolare e aggiungere acqua a 250 millilitri, conservare a temperatura ambiente protetta dalla luce. Quindi, preparare la soluzione A aggiungendo 10 millilitri di acido cloridrico molare freddo di ghiaccio a 0,3 grammi di acido ascorbico Sciogliere l'acido ascorbico con il vortice. Preparare la soluzione B aggiungendo un millilitro di acqua ghiacciata a 70 milligrammi di tetratiomodato tetraidrato di ammonio e vortice da sciogliere.
Conservare le soluzioni A e B sul ghiaccio. Preparare lo standard fosfato con una concentrazione pari a zero, 62,5, 250 e 500 micromolari per la taratura. Aggiungere zero microlitri, 12,5 microlitri, 50 microlitri e 100 microlitri di diidrato di fosfato disodico millimolare a quattro micro tubi contenenti 370 microlitri della miscela di reazione.
Ricarica fino a un millilitro con acqua. Ora aggiungere un millilitro della soluzione B a 10 millilitri di soluzione A, mescolare a mano e conservare la soluzione sul ghiaccio. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 40 microlitri di zero, 62,5, 250 e 500 standard di fosfato micromolare agli script del tubo in triplice copia.
Aggiungere quindi 25 microlitri di soluzione composta e 15 microlitri di miscela di soluzioni M-P-P-A di ciascun tubo. Ad eccezione dei tubi contenenti norma fosfato. Sigillare le strisce del tubo con un foglio di tenuta adesivo.
Tagliare il foglio di tenuta per separare ogni nastro del tubo. Successivamente, pre incubare il campione per cinque minuti a 71 gradi Celsius. Posizionare il campione sul blocco riscaldante con intervalli di 20 secondi tra ogni striscia.
Per ogni striscia, aprire la sigillatura adesiva. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 100 microlitri di due dibasici molari di pirofosfato di sodio. E mescolare pipettando su e giù per cinque volte.
Sigillare nuovamente la striscia del tubo utilizzando la stessa sigillatura. Incubare di nuovo a 71 gradi Celsius per cinque minuti. Successivamente, posizionare i campioni sull'apparecchio di raffreddamento con un intervallo di 20 secondi tra ogni striscia.
Lasciare raffreddare per cinque minuti e quindi centrifugare brevemente ogni striscia per decantare le gocce d'acqua sotto il foglio di tenuta. Rimettere la striscia all'apparecchio di raffreddamento, rimuovere la sigillatura e lasciarla raffreddare per altri cinque minuti. Quindi aggiungere 60 microlitri della soluzione A e B, mescolare tubazione su e giù per cinque volte e mantenere le strisce del tubo sull'apparecchio di raffreddamento per altri 10 minuti.
In una cappa aspirante aggiungere 90 microlitri della soluzione di citrato di arsenite e mantenere a temperatura ambiente per almeno 30 minuti. Per produrre un colore blu stabile. Distribuire 180 microlitri di ogni miscela di reazione in una chiara micropiatta di polistirolo a 96 polietilene.
Utilizzare uno spettrofotometro a micropiastra per misurare l'assorbanza di ogni pozzo a 860 nanometri. In questo protocollo, otto composti sono stati testati insieme all'I-D-P, un comune inibitore della pirofosfatasi come controllo positivo. Dopo l'aggiunta della soluzione A e B e del citrato di arsenite, un colore blu in 30 minuti di incubazione a temperatura ambiente.
Tutte e tre le concentrazioni di composti non inibitori, mostravano la stessa intensità di colore blu. Così come da E-1 a E-3 senza alcun inibitore. La trama dell'attività enzimatica contro la concentrazione di ogni composto testato mostra che il composto con attività di inibizione formava un raccordo a curva non lineare.
La trama dell'I-D-P come controllo positivo, mostra chiaramente una diminuzione dell'attività a concentrazioni più elevate. La curva di inibizione per i composti uno, cinque, sei, sette e otto. Mostra concentrazioni inibitorie semi massime a 1,7 micromolari, 21,4 micromolari, 58,8 micromolari, 239,0 micromolari e superiori a 500 micromolari, rispettivamente.
Ricordati di prepararti, la soluzione M-P-P-A. Poco prima dell'inizio del saggio.
