우리의 프로토콜은 막 바운드 파이로포스파타제의 탈활성을 억제하는 화합물을 찾는 도구로 작동합니다. 그리고 이 억제제는 몇몇 기생질병의 처리에 사용될 수 있다. 이 프로토콜은 효소 재활성화에 필요한 높은 인지질 농도의 존재시 간섭을 나타내지 않고 오랫동안 안정적이고 안정적인 색상을 생산하는 저렴하고 간단합니다.
PH 6.5에서 20 밀리머 M-E-S, 볼륨 글리세롤3.5% 부피, 밀리몰러 D-T-T, 0.05%D-M을 함유한 재활성화 버퍼 용액 10밀리리터를 준비한다. PH 8에서 200 밀리머 트리스 염산염을 함유한 반응 믹서 10밀리리터를 준비한다. 염화 마그네슘 8개, 염화칼륨 333개, 염화나트륨 67개.
효소 재활성화를 위해 밀리리터 리포솜당 30밀리그램을 준비하십시오. 먼저, PH 8에 20 밀리리터의 10 밀리리터를 추가하고, 1밀리머 D-T-T에서 0.3 그램의 L 알파 포스파디델콜린을 두콩에서 넣습니다. 리포솜을 얼음 위에 놓고 1초 의 간격으로 1초 동안 초음파 처리합니다.
1분 동안 일시 중지하고 솔루션이 투명하게 노란색이 될 때까지 반복합니다. 100 마이크로리터의 리포솜을 알리코트하고 액체 질소를 동결하고 사용할 때까지 음의 섭씨 80도에 저장합니다. 효소를 다시 활성화하려면 실온에서 리포솜 용액을 해동하십시오.
리포솜 용액 40마이크로리터를 20%의 D-D-M 22.5 마이크로리터와 혼합합니다. 혼합물을 섭씨 55도에서 15분간 유지합니다. 그리고 실온으로 식힙니다.
그런 다음 재활성화 버퍼 용액의 36.5 마이크로리터를 추가합니다. 혼합. 그리고 밀리리터 당 0.13 밀리그램의 총 농도를 만들기 위해 농축 된 단백질의 마이크로 리터를 추가합니다. 다음으로, 재활성화 효소의 마이크로리터 20을 반응 혼합물의 1480 마이크로리터로 이송한다.
부드럽게 섞어서 즉시 사용하십시오. 첫째, D-M-S-O의 화합물을 용해하여 200 마이크로리터에서 50 밀리몰러의 스톡 솔루션을 만듭니다. 수용성 화합물의 경우 마이크로 튜브에서 1 밀리리터로 물로 스톡 용액을 희석하여 2, 10 및 100 마이크로몰러를 제공합니다.
각 희석에 대해 적절한 혼합을 위한 화합물 용액을 소용돌이시다. 그 후, 복합 발산을 확인하고, 멀티채널 파이펫을 사용하여, 반응 혼합물의 75 마이크로리터를 96웰 플레이트에서 각각 의 음으로 분배한다. 각 화합물과 물의 75마이크로리터를 삼중판에 제어할 수 있는 것으로 추가하고, 5회 위아래로 파이프를 섞어 섞는다.
마이크로 플레이트 nephelometer를 사용하여 300 볼트에서 각 우물을 측정합니다. 현체 구연산 용액을 준비하려면, 5그램의 나트륨 아르세라이트와 5그램의 구연산 나트륨을 분화하여 두 화합물을 100밀리리터의 물로 녹입니다. 그런 다음 빙하 아세트산 5 밀리리터를 추가합니다.
혼합하고 250 밀리리터에 물을 넣고 빛으로부터 보호받는 실온에서 보관하십시오. 다음으로, 10 밀리리터의 얼음 냉기를 첨가하여 A를 준비하여 0.3 그램의 아스코르브 산에 아스코르브 산이 소용돌이에 의해 아스코르브 산을 녹입니다. 1밀리리터의 얼음 냉수를 70밀리그램에 첨가하여 용액 B를 준비하여 용해해질인 테트라티오몰리브테 테트라하이드라트, 소용돌이를 녹입니다.
얼음에 솔루션 A와 B를 저장합니다. 보정을 위해 0, 62.5, 250 및 500 마이크로몰러의 농도로 인산염 표준을 준비한다. 반응 혼합물의 370 마이크로리터를 포함하는 4개의 마이크로 튜브에 마이크로리터 제로, 12.5 마이크로리터, 50 마이크로리터, 5 밀리머 디소이소 인산염 의 100 마이크로리터를 첨가한다.
최대 1밀리리터를 물로 얹습니다. 이제 솔루션 A의 10 밀리리터에 1 밀리리터의 솔루션 B를 넣고 손으로 섞고 용액을 얼음에 저장합니다. 멀티채널 파이펫을 사용하여 트리플리케이트의 튜브 스크립트에 0, 62.5, 250 및 500 마이크로몰러 인산염 표준40마이크로리터를 추가합니다.
그런 다음 화합물 용액 25 마이크로리터와 각 튜브의 M-P-P-A 용액 혼합물 15 마이크로리터를 추가합니다. 인산염 표준을 포함하는 튜브를 제외하고. 접착제 밀봉 시트로 튜브 스트립을 밀봉합니다.
각 튜브 스트립을 분리하기 위해 밀봉 시트를 잘라냅니다. 다음으로, 섭씨 71도에서 5분간 샘플을 미리 배양합니다. 각 스트립 사이에 20초 간격으로 샘플을 가열 블록에 놓습니다.
각 스트립에 대해 접착제 밀봉을 엽니다. 멀티채널 파이펫을 사용하여 2개의 어금니 나트륨 파이로포스페이트 디베이직100마이크로리터를 추가합니다. 그리고 5 번 위아래로 파이펫으로 섞는다.
동일한 밀봉을 사용하여 튜브 스트립을 다시 밀봉합니다. 5 분 동안 섭씨 71도에서 다시 배양하십시오. 그 후, 각 스트립 사이에 20 초 간격으로 냉각 장치에 샘플을 배치합니다.
5분 동안 식힌 다음 각 스트립을 원심분리하여 밀봉 시트 아래에 물 방울을 떨어뜨리십시오. 스트립을 냉각 장치에 다시 넣고 밀봉을 제거하고 5 분 동안 식힙니다. 그런 다음 60 마이크로리터의 용액 A와 B를 추가하고, 5회 위아래로 파이프팅하여 혼합하고, 냉각 장치에 튜브 스트립을 10분 이상 유지한다.
연기 후드에, 비염석 구연산용액의 90 마이크로리터를 추가하고 적어도 30 분 동안 실온에서 유지합니다. 안정적인 청색을 연출합니다. 명확한 96 웰 폴리스티렌 마이크로 플레이트에 각 반응 혼합물의 180 마이크로 리터를 분배.
마이크로 플레이트 분광광계를 사용하여 860 나노미터에서 각 웰의 흡광도를 측정합니다. 이 프로토콜에서, 8개의 화합물은 I-D-P와 함께 시험되었다, 양성 대조군으로 파이로 포스파타제의 일반적인 억제제. 용액 A와 B, 그리고 구연산염을 첨가한 후, 실온에서 30분 만에 청색을 한다.
비 억제 화합물의 세 가지 농도 모두 동일한 파란색 강도를 표시했다. 뿐만 아니라 E-1에 E-3 어떤 억제제 없이. 각 시험된 화합물의 농도에 대한 효소 활성의 플롯은 억제 활성을 가진 화합물이 비선형 곡선 피팅을 형성했다는 것을 보여준다.
긍정적 인 제어로 I-D-P의 플롯은 분명히 더 높은 농도에서 활동의 감소를 보여줍니다. 화합물에 대한 억제 곡선은 1, 5, 6, 7 및 8. 1.7 마이크로몰라, 21.4 마이크로몰어, 58.8 마이크로몰어, 239.0 마이크로몰어, 500 마이크로몰어에서 각각 최대 억제 농도를 나타낸다.
M-P-P-A 솔루션을 준비하는 것을 기억하십시오. 분석이 시작되기 직전에.
