Notre protocole fonctionne comme un outil pour trouver des composés qui inhibe la désintérorité de la pyrophosphatase liée à la membrane. Et ces inhibiteurs peuvent être utilisés dans le traitement de plusieurs maladies parasitaires. Ce protocole est bon marché et simple produisant la couleur stable pendant longtemps sans montrer n’importe quelle interférence en présence de la concentration élevée de phospholipide exigée pour la réactivation enzymatique.
Préparez 10 millilitres de la solution tampon de réactivation, contenant 20 millimolaires M-E-S à PH 6,5, 3,5% volume en volume glycérol, deux millimolaireS D-T-T, et 0,05%D-D-M. Préparer 10 millilitres du mélangeur de réaction, contenant 200 millimolaires tris hydrochlorure à PH huit. Chlorure de magnésium de huit millimlaires, chlorure de potassium de 333 millimlaires et chlorure de sodium de 67 millimlaires.
Préparer 30 milligrammes par liposomes millilitres pour la réactivation des enzymes. Tout d’abord, ajouter 10 millilitres de 20 millimillires de tris hydrochlorure à PH huit, avec un millimolaire D-T-T à 0,3 grammes de L alpha phosphatidylcholine de fèves de sève de sève de sève. Mettez le liposome sur la glace et sonicate avec une seconde post-intervalles pendant une minute.
Faites une pause d’une minute et répétez jusqu’à ce que la solution devienne jaune transparent. Aliquot les liposomes en 100 microlitres, congeler l’azote liquide et stocker à 80 degrés Celsius négatif jusqu’à ce qu’il soit utilisé. Pour réactiver l’enzyme, décongeler la solution liposome à température ambiante.
Mélanger 40 microlitres de la solution liposome avec 22,5 microlitres de 20%D-D-M. Garder le mélange à 55 degrés Celsius pendant 15 minutes. Et laissez-le refroidir à température ambiante.
Ajouter ensuite 36,5 microlitres de la solution tampon de réactivation. Mélanger. Et ajouter un microlitre de protéines concentrées pour faire une concentration totale de 0,13 milligramme par millilitre. Ensuite, transférez 20 microlitres de l’enzyme réactivée à 1480 microlitres du mélange de réaction.
Mélanger délicatement et utiliser immédiatement. Tout d’abord, dissoudre les composés dans D-M-S-O pour faire des solutions de stock de 50 millimolar en 200 microlitres. Pour les composés solubles diluer la solution de stock avec de l’eau à un millilitre dans des micro tubes, pour donner deux, 10, et 100 micromolaire.
Pour chaque dilution, vortex la solution composée pour un bon mélange. Après cela, vérifiez la divergation composée, et à l’aide d’un pipet multicanal, distribuez 75 microlitres du mélange de réaction dans chaque puits dans une plaque de 96 puits. Ajouter 75 microlitres de chaque composé et de l’eau comme contrôle dans le triplicate, et mélanger en pipetting de haut en bas cinq fois.
Mesurez chaque puits à 300 volts à l’aide d’un néphélomètre microplaqué. Pour préparer la solution de citrate d’arsénite, poids cinq grammes d’arsénite de sodium et cinq grammes de dihydrate de citrate de trisodique, dissoudre les deux composés en 100 millilitres d’eau. Ajouter ensuite cinq millilitres d’acide acétique glaciaire.
Mélanger et ajouter de l’eau à 250 millilitres, conserver à température ambiante à l’abri de la lumière. Ensuite, préparer la solution A en ajoutant 10 millilitres d’acide chlorhydrique molaire de 0,5 molaire à 0,3 grammes d’acide ascorbique Dissoudre l’acide ascorbique par vortex. Préparez la solution B en ajoutant un millilitre d’eau glacée à 70 milligrammes de tétrathiomolybdate d’ammonium tétrathiomolybdate et vortex pour dissoudre.
Conserver la solution A et B sur la glace. Préparer la norme de phosphate avec une concentration de zéro, 62,5, 250 et 500 micromolaires pour l’étalonnage. Ajouter zéro microlitres, 12,5 microlitres, 50 microlitres et 100 microlitres de phosphate disodique millimolaire dihydrate à quatre micro tubes contenant 370 microlitres du mélange de réaction.
Garnir jusqu’à un millilitre d’eau. Maintenant, ajoutez un millilitre de solution B à 10 millilitres de solution A, mélangez à la main et stockez la solution sur la glace. À l’aide d’un pipet multicanal, ajouter 40 microlitres de zéro, 62,5, 250 et 500 micromolaires de phosphate standard aux scripts de tube en triplicate.
Ajoutez ensuite 25 microlitres de solution composée et 15 microlitres de mélange de solution M-P-P-A de chaque tube. Sauf les tubes contenant de la norme de phosphate. Sceller les bandes de tube à l’intérieur d’une feuille d’étanchéité adhésive.
Couper la feuille d’étanchéité pour séparer chaque bande de tube. Ensuite, précuber l’échantillon pendant cinq minutes à 71 degrés Celsius. Placez l’échantillon sur le bloc chauffant avec des intervalles de 20 secondes entre chaque bande.
Pour chaque bande, ouvrez l’étanchéité adhésive. À l’aide d’un pipet multicanal, ajouter 100 microlitres de deux dibasic molaires de pyrophosphate de sodium. Et mélanger en pipetting de haut en bas pendant cinq fois.
Sceller à nouveau la bande de tube à l’aide du même scellement. Incuber à nouveau à 71 degrés Celsius pendant cinq minutes. Après cela, placez les échantillons sur l’appareil de refroidissement avec un intervalle de 20 secondes entre chaque bande.
Laissez-les refroidir pendant cinq minutes, puis centrifugez brièvement chaque bande pour décanter les gouttes d’eau sous la feuille d’étanchéité. Remettre la bande à l’appareil de refroidissement, retirer l’étanchéité et laisser refroidir encore cinq minutes. Ajouter ensuite 60 microlitres de solution A et B, mélanger en pipetant de haut en bas pendant cinq fois, et garder les bandes de tube sur l’appareil de refroidissement pendant 10 minutes de plus.
Dans une hotte fumigène, ajouter 90 microlitres de la solution de citrate d’arsène et conserver à température ambiante pendant au moins 30 minutes. Pour produire une couleur bleue stable. Distribuez 180 microlitres de chaque mélange de réaction dans une microplaque de polystyrène claire de 96 puits.
Utilisez un spectrophotomètre microplaqué pour mesurer l’absorption de chaque puits à 860 nanomètres. Dans ce protocole, huit composés ont été examinés avec I-D-P, un inhibiteur commun de pyro phosphatase comme contrôle positif. Après l’ajout de la solution A et B, et du citrate d’arsénite, une couleur bleue en 30 minutes d’incubation à température ambiante.
Les trois concentrations de composés non inhibants, ont montré la même intensité de couleur bleue. Ainsi que E-1 à E-3 sans aucun inhibiteur. L’intrigue de l’activité enzymatique contre la concentration de chaque composé testé, montre que le composé avec l’activité d’inhibition a formé un raccord de courbe non ligneaire.
L’intrigue de l’I-D-P comme un contrôle positif, montre clairement une diminution de l’activité à des concentrations plus élevées. La courbe d’inhibition pour les composés un, cinq, six, sept et huit. Montre des concentrations inhibitrices demi-maximales à 1,7 micromolaire, 21,4 micromolaires, 58,8 micromolaires, 239,0 micromolaires et plus de 500 micromolaires, respectivement.
N’oubliez pas de préparer, la solution M-P-P-A. Juste avant le début de l’analyse.
