Unser Protokoll arbeitet als Werkzeug, um Verbindungen zu finden, die die Deaktivität von membrangebundener Pyrophosphatase hemmen. Und diese Inhibitoren können bei der Behandlung mehrerer parasitanischer Erkrankungen verwendet werden. Dieses Protokoll ist billig und einfach produzieren stabile Farbe für eine lange Zeit ohne jede Störung in Gegenwart von hoher Phospholipid-Konzentration für die Enzymreaktivierung erforderlich.
Bereiten Sie 10 Milliliter der Reaktivierungspufferlösung vor, die 20 Millimolar M-E-S bei PH 6.5, 3,5% Volumenglyzerin, zwei Millimolar D-T-T und 0,05%D-D-M enthält. Bereiten Sie 10 Milliliter des Reaktionsmischers vor, der 200 Millimolartrishydrochlorid bei PH 8 enthält. Acht Millimolar-Magnesiumchlorid, 333 Millimolar-Kaliumchlorid und 67 Millimolar-Natriumchlorid.
Zur Vorbereitung von 30 Milligramm pro Milliliter Liposomen für die Enzymreaktivierung. Fügen Sie zunächst 10 Milliliter 20 Millimolar Trishydrochlorid bei PH 8 hinzu, mit einem Millimolar D-T-T bis 0,3 Gramm L Alpha Phosphatidylcholin aus Sojabohnen. Das Liposom auf Eis legen und mit einer Sekunde Nachintervallfür eine Minute beschallen.
Halten Sie eine Minute an, und wiederholen Sie, bis die Lösung transparent gelb wird. Aliquot die Liposomen in 100 Mikroliter, gefrieren Sie den flüssigen Stickstoff und speichern Bei negativen 80 Grad Celsius, bis verwendet. Um das Enzym zu reaktivieren, tauen Sie die Liposomenlösung bei Raumtemperatur auf.
Mischen Sie 40 Mikroliter der Liposomenlösung mit 22,5 Mikrolitern 20%D-D-M. Halten Sie die Mischung bei 55 Grad Celsius für 15 Minuten. Und lassen Sie es auf Raumtemperatur abkühlen.
Fügen Sie dann 36,5 Mikroliter der Reaktivierungspufferlösung hinzu. Mischen. Und fügen Sie einen Mikroliter konzentriertes Protein, um eine Gesamtkonzentration von 0,13 Milligramm pro Milliliter zu machen. Als nächstes übertragen Sie 20 Mikroliter des reaktivierten Enzyms auf 1480 Mikroliter des Reaktionsgemisches.
Mischen Sie sanft und sofort verwenden. Lösen Sie zunächst die Verbindungen in D-M-S-O auf, um Lagerlösungen von 50 Millimolar in 200 Mikrolitern herzustellen. Bei löslichen Verbindungen verdünnen Sie die Stammlösung mit Wasser auf einen Milliliter in Mikroröhrchen, um zwei, 10 und 100 Mikromolar zu geben.
Für jede Verdünnung, Wirbel die zusammengesetzte Lösung für das richtige Mischen. Danach prüfen Sie die zusammengesetzte Divergation und geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 75 Mikroliter des Reaktionsgemisches in jeden Brunnen in einer 96-Well-Platte aus. Fügen Sie 75 Mikroliter jeder Verbindung und Wasser als Kontrolle in Dreifacharbeit, und mischen, indem Sie fünf Mal nach oben und unten.
Messen Sie jeden Brunnen bei 300 Volt mit einem Mikroplatten-Nephelometer. Zur Herstellung der Arsenitcitratlösung, Gewicht fünf Gramm Natriumarsenit und fünf Gramm Trinatriumcitratdihydrat, lösen Beide Verbindungen in 100 Milliliter Wasser. Dann fügen Sie fünf Milliliter Eisessigsäure.
Mischen, und fügen Sie Wasser auf 250 Milliliter, lagern bei Raumtemperatur vor Licht geschützt. Als nächstes bereiten Sie Lösung A vor, indem Sie 10 Milliliter eiskalte 0,5 molare Salzsäure zu 0,3 Gramm Ascorbinsäure auflösen Sie die Ascorbinsäure durch Wirbeln. Bereiten Sie Lösung B vor, indem Sie 70 Milligramm Ammoniumtetrathiomolybdattetrahydrat einen Milliliter eiskaltes Wasser hinzufügen und sich auflösen.
Lösung A und B auf Eis speichern. Zur Herstellung des Phosphatstandards mit einer Konzentration von Null, 62,5, 250 und 500 Mikromolaren für die Kalibrierung. Fügen Sie null Mikroliter, 12,5 Mikroliter, 50 Mikroliter und 100 Mikroliter 5 Millimolar-Dinatriumphosphat-Dihydrat zu vier Mikroröhren hinzu, die 370 Mikroliter des Reaktionsgemischs enthalten.
Auf einen Milliliter mit Wasser aufladen. Nun einen Milliliter Lösung B auf 10 Milliliter Lösung A geben, von Hand mischen und auf Eis lagern. Mit einer Mehrkanalpipette fügen Sie 40 Mikroliter Null, 62,5, 250 und 500 Mikromolarphosphatstandard zu den Rohrskripten in Dreifache hinzu.
Dann fügen Sie 25 Mikroliter Zusammengesetzte Lösung und 15 Mikroliter M-P-P-A Lösung Mischung von jedem Rohr. Mit Ausnahme der Rohre, die Phosphatstandard enthalten. Versiegeln Sie die Rohrstreifen mit einer Klebedichtungsfolie.
Schneiden Sie die Dichtplatte, um jeden Rohrstreifen zu trennen. Als nächstes, pre inkubieren Sie die Probe für fünf Minuten bei 71 Grad Celsius. Legen Sie die Probe auf den Heizblock mit 20 Sekunden Intervallen zwischen den einzelnen Streifen.
Öffnen Sie für jeden Streifen die Klebedichtung. Mit einer Mehrkanalpipette 100 Mikroliter von zwei molaren Natriumpyrophosphat dibasic hinzufügen. Und mischen Sie, indem Sie fünf Mal nach oben und unten pfeifen.
Versiegeln Sie den Rohrstreifen erneut mit der gleichen Dichtung. Wieder bei 71 Grad Celsius für fünf Minuten inkubieren. Danach legen Sie die Proben auf das Kühlgerät mit 20 Sekunden Intervall zwischen den einzelnen Streifen.
Lassen Sie sie fünf Minuten abkühlen und zentrieren Sie dann jeden Streifen kurz, um die Wassertropfen unter der Dichtplatte zu dekantieren. Legen Sie den Streifen wieder auf das Kühlgerät, entfernen Sie die Abdichtung und lassen Sie sie für weitere fünf Minuten abkühlen. Dann 60 Mikroliter Lösung A und B hinzufügen, fünfmal durch Pipetten nach oben und unten mischen und die Rohrstreifen noch 10 Minuten am Kühlgerät aufbewahren.
In einer Dunstabzugshaube 90 Mikroliter der Arsenitcitratlösung hinzufügen und mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur aufbewahren. Um eine stabile blaue Farbe zu erzeugen. 180 Mikroliter jedes Reaktionsgemisches in eine klare 96-Well-Polystyrol-Mikroplatte geben.
Verwenden Sie ein Mikroplattenspektrophotometer, um die Absorption jedes Brunnens bei 860 Nanometern zu messen. In diesem Protokoll wurden acht Verbindungen zusammen mit I-D-P, einem gemeinsamen Inhibitor der Pyrophosphatase als Positivkontrolle, getestet. Nach dem Hinzufügen von Lösung A und B, und Arsenit citrat, eine blaue Farbe in 30 Minuten der Inkubation bei Raumtemperatur.
Alle drei Konzentrationen von nicht hemmenden Verbindungen, zeigten die gleiche blaue Farbintensität. sowie E-1 bis E-3 ohne Inhibitor. Die Darstellung der enzymatischen Aktivität gegen die Konzentration jeder getesteten Verbindung zeigt, dass die Verbindung mit Hemmungsaktivität eine nichtlineare Kurvenanpassung bildete.
Die Handlung von I-D-P als positiver Kontroller zeigt deutlich eine Abnahme der Aktivität bei höheren Konzentrationen. Die Hemmungskurve für die Verbindungen eins, fünf, sechs, sieben und acht. Zeigt die halbmaximale hemmende Konzentration bei 1,7 Mikromolaren, 21,4 Mikromolaren, 58,8 Mikromolaren, 239,0 Mikromolaren und mehr als 500 Mikromolaren.
Denken Sie daran, die M-P-P-A-Lösung vorzubereiten. Kurz vor Beginn des Testes.
