يوفر هذا البروتوكول نماذج PDAC قابلة للتكرار وذات كفاءة مناعية في الجسم الحي مناسبة لدراسات النمط الجيني والنمط الظاهري والاستجابة للأدوية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي قدرتها على المساعدة في التحقيق في تطور الورم مع بيئة ميكروبية بيولوجية وراثية للورم مع الحفاظ على قابلية استنساخ التجربة. سيتم توضيح الإجراء ستيفاني بارثيل وكيارا فالكوماتا ، وكلاهما من مختبرنا.
ابدأ في تحضير الخلايا السرطانية عن طريق غسل سرطان البنكرياس الغدي القنوي ، أو خلايا PDAC ، المزروعة في قارورة ثقافة T75 مع محلول ملحي مخزن بالفوسفات أو PBS. ثم أضف 0.5 ملليلتر من التربسين لمدة خمس إلى 10 دقائق للفصل عن الدورق. أعد تعليق الخلايا المنفصلة في 10 ملليلتر من DMEM مع مصل بقري جنيني 10٪ ، أو FBS ، و 0.1٪ بنسلين ستربتومايسين قبل نقل تعليق الخلية إلى أنبوب 15 ملليلتر.
أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلية في 200G لمدة خمس دقائق ونضح طاف. أعد تعليق حبيبات الخلية في DMEM بدون إضافات ، بناء على التركيز النهائي المطلوب للخلايا للحقن. عد الخلايا في 10 ميكرولتر من تعليق الخلية ، باستخدام غرفة نيوباور واحسب عدد الخلايا المتاحة.
انقل ملليلترا واحدا من التعليق المخفف ، وفقا للتركيز النهائي المطلوب ، إلى أنبوب سعة 1.5 ملليلتر. ضع الأنبوب على المدور حتى الزرع لمنع تراكم الخلايا. لزرع خلايا PDAC التقويمية ، ضع كريم العين على الفأر المشدود أثناء نوم الفأر.
تحقق من التخدير الكافي قبل حلق الجانب الأيسر البطني للفأر المشتعل. ضع الماوس ، مستلقيا على الجانب الأيمن ، على حصيرة تسخين معقمة وربط الساقين بالسطح. ارتداء قفازات جديدة وتطهيرها.
باستخدام المقص الجراحي ، قم بقطع حوالي سنتيمتر واحد من الجلد والأنسجة الدهنية تحت الجلد طوليا على الجانب الأيسر حيث يتم إسقاط الطحال. باستخدام المقص والملقط ، افصل الجلد عن الصفاق لتسهيل الوصول إلى الصفاق. قم بتغيير زوج المقص قبل فتح الصفاق في موقع الطحال بقطع طولي سنتيمتر واحد.
أثناء تعبئة الطحال والبنكرياس المتصل باستخدام ملقط حاد ودقيق ، تأكد من عدم ربط الأعضاء بأنسجة أخرى. تحقق أيضا من الأوعية الدموية الموردة لتجنب إصابة الأوعية أو الأنسجة المحيطة عند التعامل مع البنكرياس. اسحب البنكرياس بعناية من الشق لتسهيل الوصول إلى ذيل العضو ومراقبة الطحال بعد البنكرياس.
تأكد من عدم طي العضو أثناء الحقن وأن كبسولة العضو مثبتة تحت الشد في موقع اختراق الإبرة لتجنب الانسكاب. استهدف وجود قطعة من أنسجة البنكرياس بين الأوعية الدموية المرئية لتقليل خطر ثقب أو حقن الوعاء. باستخدام اليد المهيمنة ، اخترق بعناية كبسولة العضو بقنية قياس 27 وحقنة 50 ميكرولتر تتبع المحور الطولي للعضو.
بعد حقن 20 ميكرولتر من المعلق الذي يحتوي على 2،500 خلية في منطقة ذيل البنكرياس ، حافظ على البنكرياس والمحقنة المدخلة ثابتة لمدة دقيقة واحدة تقريبا لتجنب انسكاب الخلايا السرطانية. ثم قم بإزالة الإبرة من موقع الحقن. بعد ذلك ، أعد ترتيب الأعضاء داخل البطن بعناية دون إصابة الأنسجة لتجنب انسكاب الخلايا.
تجنب التصاق الأعضاء عن طريق سكب ملليلتر واحد من 0.9٪ كلوريد الصوديوم على الأعضاء. بعد خياطة الصفاق باستخدام تقنية الخياطة المتقطعة البسيطة ، أغلق الجلد باستخدام اثنين إلى ثلاثة مشابك جرح من الفولاذ المقاوم للصدأ عيار تسعة ملليمترات. ثم استعداء التخدير باستخدام الميدازولام ، ميديتومادين ، والفنتانيل ، أو MMF ، مع حقن تحت الجلد من AFN وفقا لوزن جسم الماوس.
بمجرد الانتهاء من ذلك ، ضع الماوس في غرفة ساخنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية حتى يستيقظ وينشط تماما. ضع الفأر النشط مرة أخرى في قفصه الأصلي وراقب الحالة الصحية للفأر عن طريق فحص الفراء ولون الجلد والنشاط ، وكرر ذلك بعد ثلاث إلى أربع ساعات من الجراحة. في التصوير بالرنين المغناطيسي للفأر المزروع ، تم تحسس تطعيم خلايا PDAC في وقت مبكر في حوالي سبعة أيام بعد الجراحة ، اعتمادا على عدد الخلايا المحقونة وخصائص العدوانية والنمو لخط الخلية الملقحة.
اختلف بقاء الفئران المزروعة الناتجة اعتمادا على السمات الجوهرية للخلايا السرطانية لخطوط الخلايا. أدت الحقن الناجحة داخل البنكرياس إلى أورام كاملة في بنكرياس الفأر. في المقابل ، أدت عمليات الزرع غير الناجحة إلى عدم وجود أورام البنكرياس بسبب حقن خلايا غير قابلة للحياة ، أو رفض الخلايا المزروعة ، أو حقن عدد غير كاف من الخلايا.
تذكر الانتباه إلى عدم انسكاب أي خلايا أثناء الحقن وعدم إصابة أي أنسجة محيطة لمنع الخلايا من الانتشار داخل البطن. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء الدراسات في الجسم الحي ، مثل دراسات الاستجابة للأدوية قبل السريرية ، على الفئران ذات الكفاءة المناعية ، متبوعة ، على سبيل المثال ، بالحقائق أو التسلسل أو التحليل النسيجي للتحقيق في تفاعلات مضيف الورم.
