يمكن استخدام بروتوكولنا لاختبار دور أي جين مرشح في الاستعمار والنمو السريع والسهل. كما يسمح البروتوكول بالرصد الفعلي للنقائل والتشكيل والنمو، بالإضافة إلى القياس الكمي لعدد الانبثاث والحجم في نفس الحيوانات دون الحاجة إلى استئصالها أو تلطيخ النسيج. لوحة أربع خلايا T1 في 150، 000 خلية في بئر في لوحة 12-جيدا في وسائل الإعلام النمو الكامل.
احتضان في 37 درجة مئوية 5٪ ثاني أكسيد الكربون بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، تُفطّن وسائل الإعلام من الخلايا. إضافة 500 ميكرولترات من لوسيفراز الفيروسية مفتاح و 500 ميكرولترات من البروتين الفلورسنت الفيروسية الفائقة لتصيب الخلايا في وقت واحد مع كل من لوسيفيراز والفلورسنت البروتين الفيروسية.
ثم، إضافة ميكرولتر واحد من ثمانية ملليغرام لكل ملليلتر بروميد سداسي عشري واحتضان في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 إلى 48 ساعة. تريبسينيز الخلايا الأربع T1 مع 500 ميكرولترات من التربسين. بعد دقيقتين إلى خمس دقائق، نقل جميع الخلايا إلى طبق ستة سنتيمترات في أربعة ملليلتر من وسائل الإعلام اختيار، وبالتالي إخماد التربسين.
بعد اكتمال الاختيار، تأكد من أن الخلايا الأربع المصابة T1 تعبر عن البروتين الفلوري ZsGreen باستخدام مجهر فلوري مقلوب في 50 إلى 100 مرة التكبير. تأكد أيضا من أن الخلايا الأربع المصابة T1 تعبر عن لوسيفراز باستخدام مجموعة أنشطة لوسيفراز المتاحة تجاريا. المضي قدما في تنفيذ التحسين من في التصميم التجريبي في الجسم الحي كما هو موضح في بروتوكول النص.
استلهمي الوسائط وشطفي لوحات الخلايا بـ 1X PBS. تبسينيزي الخلايا مع خمسة ملليلتر من التربسين لكل 15 لوحة سنتيمتر لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق ونقل جميع الخلايا إلى أنبوب مخروطي. غسل الخلايا المتبقية من طبق ثقافة الأنسجة مع ما يكفي من وسائل الإعلام نمو كامل لإخماد التربسين.
أضف الغسيل إلى نفس الأنبوب المخروطي. عد الخلايا باستخدام عداد خلية تلقائي لتحديد إجمالي عدد الخلايا. بعد ذلك، الطرد المركزي الخلايا في 122 مرة G لمدة ثلاث دقائق، ويتبخر المابير.
إعادة تعليق الخلايا في 1X PBS في التركيز المطلوب. هنا، يتم حقن 25،000 خلية في كل فأر و 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني. إذاً الخلايا التي أعيد تعليقها هي 250,000 خلية لكل ملليلتر
إبقاء تعليق الخلية على الجليد حتى الحقن. العمل في غطاء محرك السيارة في منشأة الحيوان، بلطف ولكن خلط الخلايا بدقة عن طريق عكس أنبوب أو باستخدام حقنة ملليلتر واحد لضمان أن يتم إعادة تعليق بشكل موحد. الآن، تحميل حقنة واحدة ملليلتر لور لوك مع تعليق الخلية وطرد فقاعات الهواء الزائدة.
ضع إبرة قياس نصف بوصة 30 على الحقنة مع شطبة وطرد فقاعات الهواء. ضع الفأر برفق في تقييد القوارض. وينبغي أن يكون الوريد الجانبي الخلفي مرئياً ومتوسعاً.
إذا لم يكن كذلك، قرصة بلطف قاعدة الذيل وتراجع الذيل في ماء الصنبور الدافئ لتمدد الأوردة. استخدام مسح الكحول لتنظيف الذيل، ثم أدخل الإبرة في الوريد الذيل، شطب الجانب حتى، وحقن 100 ميكرولترات من تعليق الخلية. إذا تم إدخال الإبرة بشكل صحيح في الوريد، فإنه ينبغي أن تنزلق بسهولة قليلا إلى الأمام والخلف، ويجب أن لا تكون هناك مقاومة عندما يتم دفع المكبس.
وينبغي أن تؤدي الحقن الناجحة أيضا في تدفق اللون الأزرق في الوريد يتحول الأبيض لبضع ثوان بعد الحقن. إزالة ببطء الإبرة، واستخدام الشاش العقيم، وتطبيق الضغط على موقع الحقن لوقف أي نزيف. العودة إلى قفص الماوس ورصد لمدة 15 دقيقة لضمان الشفاء الكامل.
قم بتشغيل جهاز التصوير الحي لحية vivo، وفتح برنامج الصور، وتسجيل الدخول. انقر فوق الزر تهيئة وانتظر حتى يتم تهيئة الجهاز. تغيير حقل العرض إلى D.For لأول مرة استخدام، تحرير إعدادات التعريض الضوئي بالنقر على تحرير، تفضيلات، الحصول، والتعرض التلقائي.
تغيير الحد الأقصى لوقت التعرض من الافتراضي 60 ثانية إلى 300 ثانية وانقر فوق "موافق". تحميل حقنة ملليلتر واحد مع D-luciferin، ثم إضافة إبرة قياس نصف بوصة 30 إلى الحقنة وطرد فقاعات الهواء. قياس وتسجيل كتلة الماوس المُجلّد.
تقييد الماوس عن طريق معسر scruff من الرقبة باستخدام أصابع الإبهام والمؤشر واستيعاب الذيل بين الإصبع الخنصر وقاعدة اليد. عكس الماوس في زاوية 45 درجة مع رأسه مشيرا إلى أسفل. أدخل الإبرة، مشطرة الجانب لأعلى، في مساحة IP الجانب الأيسر للماوس.
تأكيد الإدخال في مساحة IP عن طريق سحب وحدة تخزين صغيرة. لا ينبغي أن يكون هناك لون في قاعدة الإبرة عند سحب مرة أخرى في الفضاء IP. حقن الحجم المناسب من D-luciferin لجرعة من 150 ملليغرام لكل كيلوغرام.
مباشرة بعد إدارة D-luciferin، بدء جهاز ضبط الوقت. ضع مسطحة الماوس على ظهرها في جهاز التصوير مع أنفه في مخروط الأنف، وتأكد من أن يتم إعطاء واحد إلى نصف إلى اثنين ونصف في المئة isoflurane. انقر على مربعات الإنارة والصورة.
تغيير وقت التعرض إلى تلقائي، ثم انقر فوق الحصول على في لوحة التحكم الامتلاك. بعد التصوير، ارجع الفأر إلى قفصه وراقبه لمدة 15 دقيقة لضمان الشفاء التام. بعد القتل الرحيم، كما هو موضح في بروتوكول النص، عزل وإزالة الرئتين من كل فأر وشطف في برنامج تلفزيوني 1X لإزالة الدم الزائد.
الحصول على صور من الانبثاث ZsGreen في الفصوص في 10X في برايتفيلد وفلوريسنس باستخدام منظار الفلورسنت مع مرشح الفرقة واسعة GFP. استخدام برنامج تحليل الصور لتحديد حجم وعدد الانبثاث من الصور. لمعالجة وتحليل البيانات من الصور المكتسبة مع جهاز التصوير الحي لحية في في، فتح جميع ملفات الصور لكل فأرة في برنامج الصورة.
تأكد من أن الوحدات في إشعاع للبيانات الإنارة الحيوية والكفاءة لبيانات الفلورسنت بالنقر فوق السهم في أعلى يسار نافذة الصورة وتغييره إلى الوحدة المناسبة. استخدم الصورة من نقطة الوقت الأخيرة لإنشاء منطقة ذات أهمية، أو عائد الاستثمار، من خلال النقر أولاً على أدوات عائد الاستثمار في نافذة لوحة الأدوات. ثم قم بإدراج عائد استثمار واحد بالنقر فوق السهم وتحديد أحد.
انقر على حدود العائد على الاستثمار ونقله إلى صدر الماوس. ضبط حجم العائد على الاستثمار بحيث يغطي الصدر من الماوس ولا يستبعد إشارة. ثم انقر فوق قياس ROIs ونسخ أو اكتب الرقم الخام في ورقة Excel.
رسم وتحليل البيانات كما هو موضح في بروتوكول النص. انقر بزر الماوس الأيمن في ملف الصورة لنسخ العائد على الاستثمار ، ثم لصقه في ملفات الصور من النقاط الزمنية الأخرى وانقر فوق قياس ROIs. ناقلات الفيروس الرجعية التعبير عن جنبا إلى جنب مير-30 القائم على shRNAs تستهدف كل من YAP وTAZ يقلل من يعب وضريبة التعبير عن البروتين والنشاط النسخي في أربع خلايا T1.
تم نقل أربع خلايا لوكافيراز T1 بشكل ثابت مع نسخة ZsGreen التعبير عن هذا الناقل YAP / TAZ SHRNA جنبا إلى جنب أو رنا مير-30 تسيطر عليها القائم على shRNA. تظهر الصور الإنارة الحيوية أن المعدل الذي زاد به العبء النقيلي كان أسرع بكثير في الفئران التي تم حقنها بالخلايا التحكمية مقارنة بالفئران التي تم حقنها بالخلايا النازلة YAP/TAZ. مؤامرة من log10 تحول إشارة لوسيفيراز تقاس لكل ماوس على مدى التجربة يظهر أيضا أن معدل كان أسرع في الفئران حقن مع خلايا التحكم مقارنة مع الفئران حقن مع الخلايا ضربة قاضية YAP / TAZ.
عدد أقل بكثير من الانبثاث التي تشكلت في الفئران حقن مع الخلايا الضربة القاضية YAP / TAZ مقارنة مع الفئران مع خلايا التحكم عند عدها يدويا. ولوحظ نفس الاتجاه عند استخدام برنامج تحليل الصور. لم يقتصر الأمر على أن العديد من الانبثاثات أكثر شكل في الفئران التحكم، لكنها كانت عموما أكبر.
باستمرار، تم أيضا تخفيض العبء النقيلي في الرئتين بشكل كبير من قبل YAP / TAZ الضربة القاضية. الحقن الناجح لأعداد متساوية من الخلايا السليمة في كل فأر أمر بالغ الأهمية لضمان بيانات عالية الجودة. تذكر أن نحذر واتبع إرشادات السلامة عند العمل مع الفيروسات الرجعية المعدية وفيروسات العدس، خاصة إذا كانت الفيروسات معدية بشرية.
وقد سمحت لنا هذه التقنية لتوضيح أدوار الجينات المرشحة والإستعماء والنمو النقيلي، مما يوفر طريقة لتحديد واختبار الأهداف العلاجية الجديدة لعلاج الأمراض النقيلي. بعد هذا الإجراء، يمكن تحليل الانبثاث التي تحتوي على الرئتين عن طريق التلطيخ المناعي أو النسيجي للتحقق من كيفية تأثير الجين المعدل على الانبثاث وتحديد البروتينات الأخرى التي قد تكون متورطة.
