Unser Protokoll kann verwendet werden, um schnell und einfach die Rolle eines beliebigen Kandidatengens bei der metastasierenden Kolonisation und dem Wachstum zu testen. Das Protokoll ermöglicht auch echtzeit-Überwachung von Metastasen, Bildung und Wachstum, sowie Quantifizierung der MetastasenZahl und Größe bei den gleichen Tieren ohne die Notwendigkeit einer Resektion oder histologische Färbung. Platte vier T1-Zellen bei 150.000 Zellen pro Brunnen in einer 12-Well-Platte in kompletten Wachstumsmedien.
Inkubieren bei 37 Grad Celsius 5% Kohlendioxid über Nacht. Am nächsten Tag die Wachstumsmedien aus den Zellen ansaugen. Fügen Sie 500 Mikroliter luziferase viralen Überstand und 500 Mikroliter fluoreszierendes Protein viralen Überstand, um gleichzeitig die Zellen mit der Luziferase und fluoreszierenden Protein viralen Überwasserungsmitteln zu infizieren.
Dann fügen Sie einen Mikroliter von acht Milligramm pro Milliliter Hexadimethrinbromid hinzu und brüten bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 24 bis 48 Stunden. Trypsinisieren Sie die vier T1-Zellen mit 500 Mikroliter Trypsin. Nach zwei bis fünf Minuten alle Zellen in vier Milliliter Selektionsmedien auf eine sechs Zentimeter große Schale übertragen und so das Trypsin abschrecken.
Nachdem die Selektion abgeschlossen ist, bestätigen Sie, dass die infizierten vier T1-Zellen ZsGreen Fluoreszenzprotein mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop mit 50- bis 100-facher Vergrößerung exproszieren. Bestätigen Sie auch, dass die infizierten vier T1-Zellen Luziferase mit einem kommerziell erhältlichen Luciferase-Aktivitätskit exdrücken. Fahren Sie mit der Optimierung des in vivo experimentellen Designs fort, wie im Textprotokoll beschrieben.
Aspirieren Sie die Medien und spülen Sie die Zellplatten mit 1X PBS. Versuchen Sie die Zellen mit fünf Milliliter Trypsin pro 15 Zentimeter Platte für zwei bis fünf Minuten und übertragen Sie alle Zellen in ein konisches Rohr. Waschen Sie die verbleibenden Zellen aus der Gewebekulturschale mit genügend vollständigen Wachstumsmedien, um das Trypsin zu löschen.
Fügen Sie die Wäsche in das gleiche konische Rohr. Zählen Sie die Zellen mithilfe eines automatisierten Zellenzählers, um die Gesamtzahl der Zellen zu bestimmen. Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellen bei 122 mal G für drei Minuten, und aspirieren Sie den Überstand.
Setzen Sie die Zellen in 1X PBS in der gewünschten Konzentration wieder aus. Hier werden 25.000 Zellen in jede Maus und 100 Mikroliter PBS injiziert. Die wieder suspendierten Zellen liegen also bei 250.000 Zellen pro Milliliter.
Halten Sie die Zellsuspensionen bis zur Injektion auf Eis. Arbeiten Sie in einer Haube in der Tieranlage, mischen Sie die Zellen sanft, aber gründlich, indem Sie das Rohr invertieren oder eine Ein-Milliliter-Spritze verwenden, um sicherzustellen, dass sie gleichmäßig wieder aufgehängt werden. Laden Sie nun eine Ein-Milliliter-Luer Lock-Spritze mit der Zellsuspension und vertreiben Sie überschüssige Luftblasen.
Legen Sie eine halbe Zoll 30 Gauge Nadel auf die Spritze mit der Abschrägung nach oben und vertreiben Luftblasen. Legen Sie die Maus vorsichtig in einen Nagetier-Restrainer. Die seitliche Schwanzvene sollte sichtbar und erweitert sein.
Wenn nicht, kneifen Sie vorsichtig die Basis des Schwanzes und tauchen Sie den Schwanz in warmes Leitungswasser, um die Venen zu verdünnen. Verwenden Sie ein Alkoholtuch, um den Schwanz zu reinigen, setzen Sie dann die Nadel in die Schwanzvene, abschrägen Seite nach oben, und injizieren 100 Mikroliter Zellsuspension. Wenn die Nadel richtig in die Vene eingeführt wird, sollte sie leicht nach vorne und hinten gleiten, und es sollte kein Widerstand vorhanden sein, wenn der Kolben gedrückt wird.
Erfolgreiche Injektionen sollten auch zu einem Flush führen, bei dem die blaue Farbe der Vene für einige Sekunden nach der Injektion weiß wird. Entfernen Sie langsam die Nadel, und mit einer sterilen Gaze, Druck auf die Injektionsstelle ausüben, um jede Blutung zu stoppen. Bringen Sie die Maus in ihren Käfig und Monitor für 15 Minuten, um eine vollständige Wiederherstellung zu gewährleisten.
Schalten Sie das Live-Tierbildgerät in vivo ein, öffnen Sie die Bildsoftware und melden Sie sich an. Klicken Sie auf die Schaltfläche Initialisieren, und warten Sie, bis der Computer initialisiert ist. Ändern Sie das Sichtfeld in D.Für die erstmalige Verwendung, bearbeiten Sie belichtungseinstellungen, indem Sie auf Bearbeiten, Einstellungen, Erfassung und automatische Belichtung klicken.
Ändern Sie die maximale Belichtungszeit von der Standardbelichtungszeit von 60 Sekunden auf 300 Sekunden, und klicken Sie auf "Okay". Laden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze mit D-Luciferin, fügen Sie dann eine halbe Zoll 30-Spur-Nadel in die Spritze und vertreiben Luftblasen. Messen und aufzeichnen Sie die Masse einer anästhesierten Maus.
Halten Sie die Maus zurück, indem Sie die Schürfzeit des Halses mit Dem Daumen und den Zeigerfingern kneifen und den Schwanz zwischen dem rosa Finger und der Basis der Hand greifen. Invertieren Sie die Maus in einem 45-Grad-Winkel mit dem Nachunten-Kopf. Setzen Sie die Nadel, Abschrägung Seite nach oben, in die linke Seite der Maus IP-Raum.
Bestätigen Sie den Eintrag in den IP-Bereich, indem Sie ein kleines Volume zurückzeichnen. Es sollte keine Farbe an der Basis der Nadel vorhanden sein, wenn sie im IP-Bereich zurückgezeichnet wird. Injizieren Sie das entsprechende Volumen von D-Luciferin für eine Dosis von 150 Milligramm pro Kilogramm.
Unmittelbar nach der Verabreichung von D-Luciferin starten Sie einen Timer. Legen Sie die Maus flach auf den Rücken in das Bildgebungsgerät mit der Nase in den Nasenkegel, und stellen Sie sicher, dass ein halbes bis zweieinhalb Prozent Isofluran verabreicht wird. Klicken Sie auf die Leucht- und Fotoboxen.
Ändern Sie die Belichtungszeit auf Auto, und klicken Sie dann im Erfassungsbedienfeld auf Acquire. Nach der Bildgebung kehren Sie die Maus für 15 Minuten in ihren Käfig und Monitor zurück, um eine vollständige Wiederherstellung zu gewährleisten. Nach der Euthanasie, wie im Textprotokoll beschrieben, isolieren und entfernen Sie die Lunge von jeder Maus und spülen Sie in 1X PBS, um überschüssiges Blut zu entfernen.
Erfassen Sie Bilder von ZsGreen-Metastasen in den Lappen bei 10X in Brightfield und Fluoreszenz mit einem fluoreszierenden Stereoskop mit einem GFP-Breitbandfilter. Verwenden Sie Bildanalysesoftware, um die Größe und Anzahl der Metastasen aus den Bildern zu quantifizieren. Um die Daten aus den mit dem Live-Tierbildgerät aufgenommenen Bildern zu verarbeiten und zu analysieren, öffnen Sie alle Bilddateien für jede Maus in der Bildsoftware.
Stellen Sie sicher, dass die Einheiten in Strahlkraft für biolumineszierende Daten und Effizienz für fluoreszierende Daten sind, indem Sie auf den Pfeil oben links im Bildfenster klicken und ihn in die entsprechende Einheit ändern. Verwenden Sie das Bild vom letzten Zeitpunkt, um einen Bereich von Interesse oder ROI zu erstellen, indem Sie zuerst im Werkzeugpalettenfenster auf ROI-Tools klicken. Fügen Sie dann einen ROI ein, indem Sie auf den Pfeil klicken und einen auswählen.
Klicken Sie auf den Rand des ROI und bewegen Sie ihn auf die Brust der Maus. Passen Sie die Größe des ROI so an, dass er die Brust der Maus abdeckt und das Signal nicht ausschließt. Klicken Sie dann auf ROIs messen, und kopieren oder geben Sie die unformatierte Zahl in ein Excel-Blatt ein.
Plotten und analysieren Sie die Daten, wie im Textprotokoll beschrieben. Klicken Sie mit der rechten Maustaste in die Bilddatei, um den ROI zu kopieren, und fügen Sie ihn dann aus den anderen Zeitpunkten in Bilddateien ein, und klicken Sie auf 0,99 000 ROIs. Retrovirale Vektorexzidose, die Tandem-miR-30-basierte shRNAs exemitt, die sowohl auf YAP als auch auf TAZ abzielen, reduziert die YAP- und Steuerproteinexpression und Transkriptionsaktivität in vier T1-Zellen.
Vier T1-Luziferase-Zellen wurden mit einer ZsGreen-Exzessversion dieses Tandem-YAP/TAZ shRNA-Vektors oder einer kontrollierten miR-30-basierten shRNA stabil transduziert. Biolumineszierende Bilder zeigen, dass die Rate, mit der die metastasische Belastung zunahm, bei den Mäusen, die mit Kontrollzellen injiziert wurden, signifikant schneller war als bei den Mäusen, die mit YAP/TAZ-Knockdown-Zellen injiziert wurden. Ein Diagramm des log10 transformierten Luziferase-Signals, das im Laufe des Experiments für jede Maus gemessen wurde, zeigt auch, dass die Rate bei den Mäusen, die mit den Kontrollzellen injiziert wurden, schneller war als bei den Mäusen, die mit YAP/TAZ-Knockdown-Zellen injiziert wurden.
Deutlich weniger Metastasen, die in den Mäusen mit den YAP/TAZ-Knockdown-Zellen injiziert wurden, im Vergleich zu Mäusen mit Kontrollzellen, wenn sie manuell gezählt werden. Derselbe Trend wurde bei der Verwendung der Bildanalysesoftware beobachtet. In den Kontrollmäusen bildeten sich nicht nur viele weitere Metastasen, sondern sie waren im Allgemeinen größer.
Konsequent erweise wurde auch die metastasierende Belastung in der Lunge durch YAP/TAZ-Knockdown drastisch reduziert. Eine erfolgreiche Injektion von zellengleichen Zellen in jede Maus ist entscheidend, um qualitativ hochwertige Daten zu gewährleisten. Denken Sie daran, Vorsicht walten zu lassen und Sicherheitsrichtlinien zu befolgen, wenn Sie mit infektiösen Retroviren und Lentiviren arbeiten, insbesondere wenn die Viren infektiös sind.
Diese Technik hat es uns ermöglicht, die Rolle von Kandidatengenen und metastasierender Kolonisation und Wachstum zu veranschaulichen und eine Möglichkeit zu bieten, neue therapeutische Ziele für die Behandlung von metastasierenden Krankheiten zu identifizieren und zu testen. Im Anschluss an dieses Verfahren können lungenhaltige Metastasen durch immunfluoreszierende oder histologische Färbung weiter analysiert werden, um zu untersuchen, wie das veränderte Gen Metastasen beeinflusst, und andere Proteine zu identifizieren, die beteiligt sein könnten.
