Nosso protocolo pode ser usado para testar rapidamente e facilmente o papel de qualquer gene candidato na colonização e crescimento metastático. O protocolo também permite o monitoramento em tempo real de metástase, formação e crescimento, bem como quantificação do número e tamanho da metástase nos mesmos animais sem a necessidade de ressecção ou coloração histológica. Placa quatro células T1 a 150.000 células por poço em uma placa de 12 poços em mídia de crescimento completo.
Incubar a 37 graus Celsius 5% de dióxido de carbono durante a noite. No dia seguinte, aspire a mídia de crescimento das células. Adicione 500 microliters de supernanato viral luciferase e 500 microliters de proteína fluorescente supernante viral para infectar simultaneamente as células com as supernantes virais luciferase e proteína fluorescente.
Em seguida, adicione um microliter de oito miligramas por brometo de hexadimetrina mililitro e incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 a 48 horas. Tentepsinizar as quatro células T1 com 500 microliters de trippsina. Depois de dois a cinco minutos, transfira todas as células para um prato de seis centímetros em quatro mililitros de mídia de seleção, assim saciando a trippsina.
Após a seleção ser concluída, confirme que as quatro células T1 infectadas estão expressando proteína fluorescente ZsGreen usando um microscópio fluorescente invertido a 50 a 100 vezes a ampliação. Confirme também que as quatro células T1 infectadas estão expressando luciferase usando um kit de atividade luciferase disponível comercialmente. Prossiga para realizar a otimização do projeto experimental in vivo, conforme descrito no protocolo de texto.
Aspire a mídia e enxágue as placas celulares com 1X PBS. Tentepsinizar as células com cinco mililitros de trippsina por placa de 15 centímetros por dois a cinco minutos e transferir todas as células para um tubo cônico. Lave as células remanescentes do prato de cultura tecidual com mídia de crescimento completa suficiente para saciar a trippsina.
Adicione a lavagem ao mesmo tubo cônico. Conte as células usando um contador automático de células para determinar o número total da célula. Em seguida, centrifugar as células a 122 vezes G por três minutos, e aspirar o supernante.
Suspenda-as des suspendidas as células em 1X PBS na concentração desejada. Aqui, 25.000 células são injetadas em cada rato e 100 microliters de PBS. Então as células re-suspensas estão em 250.000 células por mililitro.
Mantenha as suspensões das células no gelo até a injeção. Trabalhando em um capuz na instalação animal, misture suavemente, mas cuidadosamente as células, invertendo o tubo ou usando uma seringa de um mililitro para garantir que elas sejam suspensas uniformemente. Agora, carregue uma seringa Luer Lock de um mililitro com a suspensão da célula e expulse bolhas de ar em excesso.
Coloque uma agulha de calibre 30 de meia polegada na seringa com o bisel para cima e expulse bolhas de ar. Coloque suavemente o mouse em um cabador de roedores. A veia lateral da cauda deve ser visível e dilatada.
Se não, aperte suavemente a base da cauda e mergulhe a cauda em água morna da torneira para dilatar as veias. Use uma limpeza de álcool para limpar a cauda, depois insira a agulha na veia da cauda, lado de bisel para cima e injete 100 microliters de suspensão celular. Se a agulha for inserida corretamente na veia, ela deve facilmente deslizar ligeiramente para frente e para trás, e não deve haver resistência quando o êmbolo é empurrado.
Injeções bem sucedidas também devem resultar em uma descarga na qual a cor azul da veia fica branca por alguns segundos após a injeção. Remova lentamente a agulha e, usando uma gaze estéril, aplique pressão no local da injeção para parar qualquer sangramento. Volte o mouse para sua gaiola e monitore por 15 minutos para garantir a recuperação completa.
Ligue o dispositivo de imagem animal in vivo vivo, abra o software de imagem e faça login. Clique no botão inicializar e aguarde a inicialização da máquina. Altere o campo de exibição para D.Para uso pela primeira vez, edite as configurações de exposição clicando em editar, preferências, aquisição e exposição automática.
Altere o tempo máximo de exposição do padrão de 60 segundos para 300 segundos e clique em ok. Carregue uma seringa de um mililitro com D-luciferin, depois adicione uma agulha de calibre 30 de meia polegada à seringa e expulse bolhas de ar. Meça e regise a massa de um rato anestesiado.
Contenha o rato beliscando o pescoço usando os dedos do polegar e do ponteiro e segurando a cauda entre o dedo mindinho e a base da mão. Inverta o mouse em um ângulo de 45 graus com a cabeça apontando para baixo. Insira a agulha, lado bisbigo para cima, no espaço IP do lado esquerdo do mouse.
Confirme a entrada no espaço IP retirando um pequeno volume. Não deve haver cor na base da agulha ao desenhar de volta no espaço IP. Injete o volume apropriado de D-luciferina para uma dose de 150 miligramas por quilograma.
Imediatamente após a administração de D-luciferina, inicie um temporizador. Coloque o mouse de costas no dispositivo de imagem com o nariz no cone do nariz, e certifique-se de que uma meia a duas por cento de isoflurane está sendo administrada. Clique nas caixas luminescentes e fotográficas.
Altere o tempo de exposição para auto e clique em adquirir no painel de controle de aquisição. Após a imagem, devolva o mouse à gaiola e monitore por 15 minutos para garantir a recuperação completa. Seguindo a eutanásia, como descrito no protocolo de texto, isole e remova os pulmões de cada rato e enxágue em 1X PBS para remover o excesso de sangue.
Adquira imagens de metástases ZsGreen nos lóbulos em 10X em Brightfield e fluorescência usando um estereoscópio fluorescente com um filtro de banda larga GFP. Use o software de análise de imagens para quantificar o tamanho e o número de metástases das imagens. Para processar e analisar os dados das imagens adquiridas com o dispositivo de imagem animal in vivo vivo, abra todos os arquivos de imagem para cada mouse no software de imagem.
Certifique-se de que as unidades estão em brilho para dados bioluminescentes e eficiência para dados fluorescentes clicando na seta no canto superior esquerdo da janela de imagem e alterando-as para a unidade apropriada. Use a imagem do ponto de última vez para criar uma região de interesse, ou ROI, clicando primeiro em ferramentas de ROI na janela da paleta de ferramentas. Em seguida, insira um ROI clicando na seta e selecionando um.
Clique na borda do ROI e mova-o para o peito do mouse. Ajuste o tamanho do ROI para que cubra o baú do mouse e não exclua o sinal. Em seguida, clique em medir ROIs e copiar ou digitar o número bruto em uma folha do Excel.
Plote e analise os dados conforme descrito no protocolo de texto. Clique com o botão direito do mouse no arquivo de imagem para copiar o ROI e, em seguida, cole-o em arquivos de imagem dos outros pontos de tempo e clique em medir ROIs. O vetor retroviral que expressa shRNAs baseados em tandem miR-30, visando tanto YAP quanto TAZ, reduz a expressão de proteína fiscal e a atividade transcricional em quatro células T1.
Quatro células de luciferase T1 foram transduzidas com uma versão expressa ZsGreen deste vetor de shRNA YAP/TAZ ou um shRNA controlado com base em miR-30. Imagens bioluminescentes mostram que a taxa em que a carga metastática aumentou foi significativamente mais rápida nos camundongos injetados com células de controle em comparação com os camundongos injetados com células de knockdown YAP/TAZ. Um gráfico do sinal de luciferase transformado log10 medido para cada rato ao longo do experimento também mostra que a taxa foi mais rápida nos camundongos injetados com as células de controle em comparação com os camundongos injetados com células de knockdown YAP/TAZ.
Significativamente menos metástases formadas nos camundongos injetados com as células de knockdown YAP/TAZ em comparação com camundongos com células de controle quando contados manualmente. A mesma tendência foi observada ao utilizar o software de análise de imagens. Não só muitas mais metástases se formaram nos ratos de controle, mas eles eram geralmente maiores.
Consistentemente, a carga metastática nos pulmões também foi drasticamente reduzida pelo knockdown YAP/TAZ. A injeção bem sucedida de números iguais de células saudáveis em cada camundongo é fundamental para garantir dados de alta qualidade. Lembre-se de ter cuidado e seguir as diretrizes de segurança ao trabalhar com retrovírus e lentivírus infecciosos, especialmente se os vírus forem infecciosos humanos.
Essa técnica nos permitiu ilustrar os papéis dos genes candidatos e da colonização e crescimento metastáticos, fornecendo uma maneira de identificar e testar novos alvos terapêuticos para o tratamento da doença metastática. Após este procedimento, metástases contendo pulmões podem ser ainda mais analisadas por manchas imunofluorescentes ou histológicas para investigar como o gene alterado está influenciando metástases e identificar outras proteínas que podem estar envolvidas.
