هذا البروتوكول يحدد كمية الانبثاث الرئوي، الذي هو سبب عدواني و عادي للوفاة المرتبطة بسرطان الثدي، مع زيادة الدقة والكفاءة في نموذج سرطان الثدي قبل الظهر. بالمقارنة مع التقنية الأصلية ، يعطي هذا البروتوكول الباحثين نتائج أسرع وأكثر اتساقًا. أنه يخفف من خطأ العد البشري من خلال تكنولوجيا الكمبيوتر سهلة الاستخدام.
يمكن أن تمتد هذه التقنية على الإطلاق إلى الأبحاث قبل الكلينيكية التي تدرس آثار علاجات سرطان الثدي على الانبثاث الرئوي من خلال السماح للباحثين بإظهار انخفاض العبء النقيلي بعد العلاج الناجح. تبدأ من خلال وضع علامة على أنبوب مخروطي 15 ملليلتر لعينة الأنسجة. ثم إضافة 2.5 ملليلتر من نوع أربعة خليط الكولاجين و 30 وحدة من elastase إلى الأنبوب.
نقل الرئة إلى نظيفة HBSS 1X جيدا ودوامة مع ملقط لإزالة أي الدم المتبقية، ثم نقله إلى لوحة ثقافة الأنسجة فارغة 3.5 سم. اجب الرئة بمقص، ثم شطف الطبق بـ 2.5 ملليلتر من HBSS ونقل HBSS مع قطع الرئة إلى أنبوب مخروطي معد بـ 15 ملليلتر مع الكولاجين وكوكتيل إيلاستاز. احتضان الأنبوب لمدة 75 دقيقة في أربع درجات مئوية على عجلة الروك أو الدورية.
وفي الوقت نفسه، تسمية أنبوب واحد 50 ملليلتر الطرد المركزي واحد و10 سم لوحة ثقافة الأنسجة لكل فأرة. إذا كان القيام تخفيف، تسمية ما يكفي من لوحات ثقافة الأنسجة لتخفيف. جلب حجم أنبوب يصل إلى 10 ملليلتر مع 1X HBSS، ثم صب محتويات أكثر من 70 ميكرومتر مصفاة الخلية في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر.
استخدام المكبس من حقنة ملليلتر واحد لطحن بلطف العينة من خلال مصفاة. الطرد المركزي الأنبوب لمدة خمس دقائق في 350 مرات G والتخلص من عظمى، ثم غسل بيليه مرتين مع 10 ملليلتر من 1X HBSS. Resuspend بيليه في 10 ملليلتر من 60 micromolar 6-thioguanine وسائل الإعلام ثقافة كاملة، وطبقة العينات في لوحات ثقافة الخلية 10 سنتيمترا باستخدام مخطط التخفيف إذا رغبت في ذلك.
احتضان لوحات في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة خمسة أيام. صب وسائل الإعلام الثقافة قبالة لوحات في حاوية النفايات المناسبة. لإصلاح الخلايا، إضافة خمسة ملليلتر من الميثانول غير مخفف إلى كل لوحة واحتضان لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، مع التأكد من دوامة الميثانول بحيث يغطي لوحة كاملة.
صب الميثانول قبالة لوحات في حاوية النفايات المناسبة، ثم شطف كل لوحة مع خمسة ملليلتر من الماء المقطر. إضافة خمسة ملليلتر من 0.03٪ الميثيلين الأزرق في لوحة واحتضان لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، مع التأكد من دوامة حل الميثيلين الأزرق بحيث يغطي لوحة كاملة. صب الميثيلين الأزرق في حاوية النفايات المناسبة وشطف كل لوحة مرة أخرى مع خمسة ملليلتر من الماء المقطر.
اقلب اللوحة رأسا على عقب ولطخها على منشفة ورقية لإزالة السائل الزائد. ضع اللوحة على غطاءها واتركها تجف بين عشية وضحاها. المستعمرات النقيلي ستكون زرقاء
مرة واحدة قد جفت لوحات، ويمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة إلى أجل غير مسمى. إزالة الأغطية المسمى من لوحات، مع الحرص على ضمان تحديد واضح للعينات. صف جميع لوحات الرئة الملطخة على سطح نظيف وخفيف.
التقاط صورة من مجموعة من لوحات في منطقة مضاءة جيدا، مع التأكد من تقليل انعكاسات. سوف انعكاسات في لوحات تؤثر على تحليل الصورة وينبغي تجنبها. إيلاء اهتمام وثيق للصور الفوتوغرافية التي اتخذت، والتقاط عدة صور من عدة زوايا.
بعد تصوير اللوحات، قم بقص الصورة لاستبعاد الأغطية أو أي شيء في الخلفية. افتح الصورة في Fiji ImageJ ثم غيرها إلى الأبيض والأسود بالنقر فوق الصورة، وضبط، وعتبة اللون. ثم حدد الافتراضي لأسلوب العتبة، بالأسود والأبيض للون عتبة، ومختبر لمساحة اللون.
تأكد من عدم تحديد مربع الخلفية الداكنة. يجب أن تكون الصورة الآن بالأبيض والأسود. يمثل الأسود خلفية الضوء، والأبيض يمثل المستعمرات النقيلي الأزرق.
استخدم أداة الدائرة لتحديد المنطقة التي سيتم تحليلها. رسم دائرة واحدة لاستخدامها لجميع لوحات لضمان أن يتم تحليل كل لوحة لنفس المساحة الحجم. اختر حجمًا يزيد من المساحة التي تم تحليلها على اللوحات مع تقليل الضوضاء الخلفية التي تظهر على حافة اللوحات.
يظهر الحجم في شريط الأدوات كما يتم رسمه. قم بتحليل الدائرة المحددة لتحديد النسبة المئوية للمنطقة البيضاء. انقر على تحليل وتحليل الجسيمات، ثم حدد صفر إلى ما لا نهاية لحجم، صفر إلى واحد للتعميم، ولا شيء للعرض.
تحقق من مربع ملخص وضرب حسنا. حرك الدائرة إلى اللوحة التالية في الصورة عن طريق الاستيلاء عليها في الوسط وكرر التحليل. نسخ ولصق النتيجة في جدول بيانات.
تمثل النسبة المئوية للمساحة، وهي النسبة المئوية للمنطقة المحددة التي تكون بيضاء، عبء النقيلي. بمجرد تحليل جميع اللوحات والصور، متوسط نسبة نتائج المنطقة بين الصور المختلفة لكل لوحة للتخفيف من أي تناقضات بين الصور. تمت مقارنة تحليل فيجي ImageJ بالعد اليدوي والتحليل الهستوولوجي.
عندما قام ثلاثة باحثين منفصلين بفرز المستعمرات النقيلية يدويًا ، كانت النتائج غير متسقة بين العدادات. وكانت نتائج فيجي إيمج جي متسقة بين عدادات لكل صورة من الصور الثلاث. تم الجمع بين النتائج من الصور الثلاث والعدادات الثلاثة لكل صفيحة الرئة.
تم حساب متوسط النتائج لكل لوحة لمراعاة الاختلافات بين الصور ، والتي وفرت نتائج متسقة بين العدادات. عند ترتيب لوحات من معظم إلى أقل النقيلي، دليل عد المتفق عليها على لوحة الأكثر التقاء ولكن جميع الرتب التالية كانت غير متناسقة. الرتب من متوسط فيجي ImageJ النتائج كانت أكثر اتساقا بين العدادات.
لإظهار أهمية تجنب التأملات في الصور ، تظهر صورة مع انعكاس اليد وتحليلها ImageJ في فيجي اللاحقة مع صورة لنفس اللوحة دون انعكاس. يمكن أن تؤثر العيوب الداكنة من سطح خلفية قذر أو بقايا عينة دم على اللوحات أيضًا سلبًا على تحليل Fiji Fiji. هذه لوحة الدم لديها اثنين فقط من المستعمرات النقيلي ولكن بقايا الظلام تسبب فيجي ImageJ للنظر في ذلك على أنها 31.6٪النقيلي.
عند محاولة هذا البروتوكول، تذكر أن تفحص الصور بعناية للتفكير، استخدم نفس الدائرة ذات الحجم لكل لوحة في الصورة، ومتوسط النتائج لكل لوحة بين ثلاث صور منفصلة على الأقل.
