طريقتنا هامة، لأنها تسمح لمتوسط الكيمياء الحيوية بتحديد ما إذا كانت العينات المعزولة باستخدام الكروماتوغرافيا المعدنية المُشلَّة ملوثة بالمعادن الانتقالية. الميزة الرئيسية هي السهولة التي يمكن بها إجراء الفحص. يستخدم المقايسة الأجهزة والتقنيات الشائعة في معظم مختبرات الكيمياء الحيوية ، ويمكن تنفيذه بسهولة وبسرعة.
بينما في هذه المقالة ونحن تطبيق هذه الطريقة للعينات معزولة مع عمود النيكل NTA، يمكن استخدام الأسلوب مع أي راتنج تقارب المعادن الأخرى. يجب على المستخدمين المرة الأولى محاولة هذا الأسلوب مع حل مخزون النيكل من التركيز المعروف. هذا وسوف أطلعهم على سير العمل ، والألوان عينة ، والراتنجات هو مبين في التغيرات الطيفية.
إثبات الإجراء سيكون كول سوين، فني من مختبري. للبدء، تشغيل واحماء مطياف الأشعة فوق البنفسجية فيس. تحديد كسور الكروماتوغرافيا التي سيتم تحليلها باستخدام مقياس طيفي للأشعة فوق البنفسجية UV-Vis مع الامتصاص البصري عند 280 نانومتر لقياس البروتين.
الحصول على 10 إلى 100 ميلليمولار عينة العازلة مع PH بين 7 و 12، مثل تريس، HEPES، MOPS، والمخزن المؤقت الفوسفات. إعداد 12٪ الوزن من قبل محلول حجم تشتت HNB في المخزن المؤقت عينة باستخدام 120 ملليغرام من كاشف HNB لكل ملليلتر من حل المخزون المعدة. قم بتعيين مقياس الطيف لجمع البيانات عند 647 نانومتر.
استخدام cuvette الكوارتز مليئة المخزن المؤقت عينة لفراغ الطيفي. إعداد حل التحكم في cuvette تحتوي على 50 ميكرولترات من مخزون HNB لكل ملليلتر من إجمالي حجم المعايرة. السماح لعنصر التحكم لاحتضان لمدة لا تقل عن ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة.
قياس وتسجيل امتصاص في 647 نانومتر لعينة التحكم. إعداد عينات من الفحص عن طريق خلط 150 ميكرولترات من المخزون HNB مع 2850 ميكرولترات من كسور البروتين المخففة بشكل مناسب مع المخزن المؤقت للعينة. السماح للعينة لاحتضان لمدة لا تقل عن ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة.
كرر تسجيل الطيف لكل كسر يتم قياسه. في حالة عدم كفاية الحصول على التخفيف ، فإن النطاق الطيفي بأكمله في 647 نانومتر ذهب. بينما مع تخفيف قوية جداً، العينة لا يمكن فصلها عن عنصر التحكم.
لتحديد تركيز المعدن في كل عينة، ابحث أولاً عن الفرق بين كل امتصاص للعينة عند 647 نانومتر من عنصر التحكم في HNB. تحديد تركيز المعادن في micromolar باستخدام الصيغة حيث DF هو عامل التخفيف لكسر مقايسة، دلتا A-B-S 647 هو تغيير امتصاص في 647 نانومتر، 3.65 مرات 10 إلى 2 السلبية يمثل معامل الانقراض من HNB، وL هو المسار الضوئي cuvette في السنتيمتر. في هذه الدراسة، يتم عرض الطيف من HNB الحرة في PH محايدة في أطياف تمثيلية من الكسور المقايسة لأيون النيكل من عزل MSP1E3D1 هنا.
لوحظ انخفاض في امتصاص 647 نانومتر مقارنة مع السيطرة HNB ، والتي تتوافق مع تشكيل HNB المجمعات في وجود معدن انتقالي. لإثبات تطبيق هذا الفحص ، تم تحليل اثنين من بروتينات سقالة الغشاء الموسومة له ، MSP1E3D1 ، MSP2N2 ، ورواية ، ثلاثة هيمي ، c-type cytochrome GSU0105 ، من الكبريتريدين الجيوبتري. تم تحويل محتوى أيونات البروتين والنيكل لكل جزء من GSU0105 بشكل كبير من بعضها البعض ، في حين أن الكسور لMSP1E3D1 وMSP2N2 التي تحتوي على معظم البروتين كان لها أعلى محتوى النيكل.
ومن الواضح أيضا أن المحتوى المعدني قد لا يكون موزعا بالتساوي بين الكسور التي تم جمعها باستخدام اللوني تقارب المعادن المعبأة. ومن المهم أن مزج بشكل كاف وثابت فارغة في جميع العينات والسماح لأوقات حضانة متساوية للفارغة في جميع العينات. ويمكن تحليل كسور البروتين ذات الاهتمام الخاص بمزيد من التحليل باستخدام قياس طيف الامتصاص الذري أو ICPMS لتأكيد التلوث المعدني واختبار أيونات البروتين المعدنية المُثبَّتة أو المقيدة بقوة.
وإلى جانب عملية الانتقال الكشف عن الرشح المعدني، يمكن استخدام هذه التقنية لقياس القرابة الملزمة في أيونات المعادن الانتقالية إلى البروتينات. HNB وأي النيكل الموجودة في العينات هي المهيجات للعيون والجلد على التوالي. وينبغي استخدام معدات الوقاية الشخصية القياسية بما في ذلك القفازات وحماية العين أثناء هذه الطريقة.
