Наш метод имеет важное значение, так как позволяет среднему биохимику быстро определить, загрязнены ли образцы, изолированные с помощью иммобилизованной хроматографии сродства металла, переходными металлами. Основным преимуществом является легкость, с помощью которой анализ может быть выполнен. Анализ использует приборы и методы, общие для большинства биохимических лабораторий, и он может быть легко и быстро реализован.
В то время как в этой статье мы применяем этот метод для образцов, изолированных с колонкой никель-NTA, метод может быть использован с любой другой смолы сродства металла. Впервые пользователи должны попробовать этот метод с никелевое решение запасов известной концентрации. Это позволит ознакомить их с рабочим процессом, цветами образцов и смолами, показанным в спектральных изменениях.
Демонстрацией процедуры будет Коул Суэйн, техник из моей лаборатории. Для начала включите и разогреете спектрофотометр UV-Vis. Определите фракции хроматографии, которые будут просасываться с помощью диодного массива УФ-vis спектрофотометр с оптическим абсорбционом на 280 нанометров для количественной оценки белка.
Получить от 10 до 100 миллимоляров буфер выборки с PH между 7 и 12, таких как Tris, HEPES, MOPS, и фосфатный буфер. Подготовь 12%-вес по объему раствор дисперсии HNB в буфере выборки с использованием 120 миллиграммов реагента HNB для каждого подготовленного миллилитра запасного раствора. Установите спектрофотометр для сбора данных на 647 нанометров.
Используйте кварцевый кювет, наполненный буфером образца, чтобы очистить спектрофотометр. Подготовье контрольного раствора в кювете, содержащем 50 микролитров запасов HNB на миллилитр общего объема анализа. Разрешить контроль инкубировать в течение как минимум трех минут при комнатной температуре.
Измерьте и замитьте абсорбанс на 647 нанометров для контрольного образца. Подготовь анализ образцов, смешивая 150 микролитров запасов HNB с 2850 микролитров надлежащим образом разбавленных белковых фракций с буфером образца. Разрешить инкубации образца в течение как минимум трех минут при комнатной температуре.
Повторите запись спектра для каждой фракции, которая будет измерена. В случае недостаточного разбавления вся спектральная полоса на 647 нанометров исчезла. Хотя при слишком сильном разбавлении образец неотличим от управления.
Чтобы определить концентрацию металла в каждом образце, сначала найдите разницу в поглощении каждого образца на 647 нанометров от контроля HNB. Определите концентрацию металла в микромоларе, используя формулу, где DF является фактором разбавления для фракции анализа, дельта A-B-S 647 является изменением абсорбции на 647 нанометров, 3,65 раза 10 к отрицательному 2 представляет собой коэффициент вымирания HNB, и l является оптическим путем cuvette в сантиметрах. В этом исследовании показан спектр свободного HNB при нейтральном PH в репрезентативных спектрах фракций, анализированных на ион никеля из изоляции MSP1E3D1.
Наблюдалось снижение абсорбции на 647 нанометров по сравнению с контролем HNB, что соответствовало образованию комплексов HNB при наличии переходного металла. Чтобы продемонстрировать применение этого анализа, были проанализированы два его помеченных мембранных леса белков, MSP1E3D1, MSP2N2, и роман, три-гем, c-типа цитохром GSU0105, от геобактерий серы, были проанализированы. Содержание белка и никеля в каждой фракции для GSU0105 было значительно сдвинуто друг от друга, в то время как фракции для MSP1E3D1 и MSP2N2, которые содержали наибольшее количество белка, также имели самое высокое содержание никеля.
Иллюстрируется также, что содержание металла не может быть равномерно распределено между фракциями, собранными с помощью мобилизованной металлоконструкций хроматографии. Наиболее важно адекватно и последовательно смешивать пробел во всех образцах и обеспечить равное время инкубации для пробела во всех образцах. Белковые фракции, представляющие особый интерес, могут быть дополнительно проанализированы с помощью атомной спектрометрии поглощения или ICPMS для подтверждения загрязнения металла и для проверки на хелатированные или сильно связанные ионы белкового металла.
Помимо обнаружения выщелачивания переходного металла, этот метод может быть использован для измерения связывающих сродства при переходе металлических ионов к белкам. HNB и любой никель, присутствующий в образцах, являются раздражителями для глаз и кожи соответственно. Стандартный СИЗ, включая перчатки и защиту глаз, следует использовать во время метода.
