Nosso método é significativo, pois permite que o bioquímico médio determine rapidamente se amostras isoladas usando cromatografia de afinidade metálica imobilizada estão contaminadas com metais de transição. A principal vantagem é a facilidade pela qual o ensaio pode ser realizado. O ensaio usa instrumentação e técnicas comuns à maioria dos laboratórios de bioquímica, e pode ser implementado de forma fácil e rápida.
Enquanto neste artigo aplicamos este método para amostras isoladas com uma coluna níquel-NTA, o método pode ser usado com qualquer outra resina de afinidade metálica. Primeira vez que os usuários devem experimentar este método com uma solução de níquel estoque de concentração conhecida. Isso irá familiarizá-los com o fluxo de trabalho, cores de amostra e resinas mostradas em alterações espectrais.
Demonstrando o procedimento será Cole Swain, um técnico do meu laboratório. Para começar, ligue e aqueça o espectrômetro UV-Vis. Determine as frações de cromatografia a serem avaliadas usando um espectrofotômetro UV-Vis com absorvção óptica a 280 nanômetros para quantificar a proteína.
Obtenha tampão amostral de 10 a 100 mililitros com um PH entre 7 e 12, como Tris, HEPES, MOPS e tampão fosfato. Prepare uma solução de 12% de peso por volume de dispersão HNB no buffer de amostra usando 120 miligramas de reagente HNB para cada mililitro de solução de estoque preparada. Defina o espectótmetro para coletar dados em 647 nanômetros.
Use uma cuvette de quartzo preenchida com o tampão de amostra para passar o espaço espectotúmetro. Prepare uma solução de controle em uma cuvette contendo 50 microliters de estoque HNB por mililitro de volume total de ensaios. Deixe o controle incubar por um mínimo de três minutos em temperatura ambiente.
Meça e regisse a absorvância em 647 nanômetros para a amostra de controle. Prepare as amostras de ensaio misturando 150 microliters de estoque HNB com 2850 microliters de frações proteicas adequadamente diluídas com o tampão amostral. Deixe a amostra incubar por um mínimo de três minutos em temperatura ambiente.
Repita o registro de espectro para que cada fração seja medida. No caso de diluição insuficiente, toda a banda espectral a 647 nanômetros se foi. Embora com diluição muito forte, a amostra é indissistível do controle.
Para determinar a concentração de metal em cada amostra, primeiro encontre a diferença de cada absorvimento amostral a 647 nanômetros do controle HNB. Determine a concentração metálica em micromolar usando a fórmula onde DF é o fator de diluição para a fração de ensaio, delta A-B-S 647 é a mudança de absorvância em 647 nanômetros, 3,65 vezes 10 para o negativo 2 representa o coeficiente de extinção do HNB, e l é o caminho óptico de Cuvette em centímetros. Neste estudo, o espectro de HNB livre em PH neutro em espectro representativo de frações avaliadas para íon níquel a partir do isolamento do MSP1E3D1 são mostrados aqui.
Observou-se uma diminuição da absorvância em 647 nanômetros em relação ao controle hnb, o que correspondeu à formação de complexos HNB na presença de um metal de transição. Para demonstrar a aplicação deste ensaio, foram analisadas duas proteínas de espeto de membrana marcadas, MSP1E3D1, MSP2N2, e um novo, citocromo c-tipo C GSU0105, de enxofre geobacter, foram analisados. O teor de íons de proteína e níquel de cada fração para GSU0105 foi significativamente deslocado um do outro, enquanto as frações para MSP1E3D1 e MSP2N2 que continham mais proteínas também apresentaram o maior teor de níquel.
Também é ilustrado que o conteúdo metálico pode não ser distribuído uniformemente entre frações coletadas por meio de uma cromatografia de afinidade metálica mobilizada. É mais importante misturar adequadamente e consistentemente o branco em todas as amostras e permitir tempos iguais de incubação para o branco em todas as amostras. Frações proteicas de interesse especial poderiam ser analisadas com espectrometria de absorção atômica ou ICPMS para confirmar a contaminação metálica e testar íons metálicos de proteínas quequeadas ou fortemente ligadas.
Além da detecção de lixiviação metálica de transição, essa técnica pode ser usada para medir afinidades vinculantes em íons metálicos de transição para proteínas. HNB e qualquer níquel presente nas amostras são irritantes para os olhos e pele, respectivamente. Epi padrão, incluindo luvas e proteção ocular devem ser usados durante o método.
