השיטה שלנו היא משמעותית, כפי שהוא מאפשר הביוכימאי הממוצע במהירות לקבוע אם דגימות מבודדות באמצעות כרומטוגרפיה זיקה מתכת משותק מזוהמים עם מתכות מעבר. היתרון העיקרי הוא הקלות שבה ניתן לבצע את ההתנצלות. ההתמדה משתמשת מכשור וטכניקות משותפות לרוב מעבדות הביוכימיה, וזה יכול להיות מיושם בקלות ובמהירות.
בעוד במאמר זה אנו מיישמים שיטה זו עבור דגימות מבודדות עם עמודת ניקל-NTA, השיטה יכולה לשמש עם כל שרפין זיקה מתכת אחר. משתמשים בפעם הראשונה צריך לנסות שיטה זו עם פתרון מלאי ניקל של ריכוז ידוע. פעולה זו תכיר להם את זרימת העבודה, הצבעים לדוגמה וההיפנים המוצגים בשינויים ספקטרליים.
הדגימה של ההליך תהיה קול סוויין, טכנאי מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, הפעל וחימום ספקטרופוטומטר UV-Vis. לקבוע את שברי הכרומטוגרפיה להיות assayed באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis מערך דיודה עם ספיגה אופטית ב 280 ננומטר לכמת את החלבון.
השג חיץ מדגם של 10 עד 100 מילימולרים עם PH בין 7 ל- 12, כגון טריס, HEPES, MOPS ומאגר פוספט. הכן 12% משקל לפי פתרון נפח של פיזור HNB במאגר מדגם באמצעות 120 מיליגרם של HNB reagent עבור כל מיליליטר של פתרון מלאי מוכן. הגדר את הספקטרופוטומטר לאיסוף נתונים ב-647 ננומטר.
השתמש בקובט קוורץ מלא במאגר הדגימה כדי לרוקן את הספקטרופוטומטר. הכן פתרון בקרה ב cuvette המכיל 50 microliters של מלאי HNB למיליליטר של נפח בדיקה הכולל. אפשר לפקד דגירה למשך שלוש דקות לפחות בטמפרטורת החדר.
למדוד ולתזמן את הספיגה ב 647 ננומטר עבור מדגם הבקרה. הכינו את דגימות ההתזה על ידי ערבוב של 150 מיקרוליטרים של מלאי HNB עם 2850 מיקרוליטרים של שברי חלבון מדוללים כראוי עם מאגר הדגימה. אפשר לדגימה להדגור במשך שלוש דקות לפחות בטמפרטורת החדר.
חזור על הקלטת הספקטרום כדי שכל שבר יימדד. במקרה שבו דילול לא מספיק מתקבל, הלהקה הספקטרלית כולה ב 647 ננומטר נעלם. בעוד עם דילול חזק מדי, המדגם אינו ניתן להתוות מהפקד.
כדי לקבוע את ריכוז המתכת בכל מדגם, מצא תחילה את ההבדל של כל ספיגת מדגם ב 647 ננומטרים מהבקרה HNB. לקבוע את ריכוז המתכת micromolar באמצעות הנוסחה שבה DF הוא גורם הדילול עבור שבר האשכים, דלתא A-B-S 647 הוא שינוי הספיגה ב 647 ננומטר, 3.65 פעמים 10 כדי שלילי 2 מייצג את מקדם ההכחדה של HNB, ואני הוא הנתיב האופטי של cuvette בסנטימטרים. במחקר זה, הספקטרום של HNB חינם ב PH ניטרלי בספקטרום מייצג של שברים שהושלאו עבור יון ניקל מהבידוד של MSP1E3D1 מוצגים כאן.
ירידה בספיגה ב-647 ננומטר בהשוואה לבקרת ה-HNB נצפתה, אשר התאים להיווצרות מתחמי HNB בנוכחות מתכת מעבר. כדי להדגים את היישום של הראי הזה, שני חלבוני פיגום קרום מתויג שלו, MSP1E3D1, MSP2N2, ורומן, שלושה heme, c-סוג ציטוכרום GSU0105, מ geobacter sulfurreducens, נותחו. תוכן החלבון וניקל יון של כל שבר עבור GSU0105 הועברו באופן משמעותי אחד מהשני, בעוד שברי MSP1E3D1 ו MSP2N2 שהכילו את החלבון ביותר היו גם את התוכן הניקל הגבוה ביותר.
זה גם מאויר כי תוכן המתכת לא יכול להיות מופץ באופן שווה בין שברים שנאספו באמצעות כרומטוגרפיה זיקה מתכת מגויסת. חשוב ביותר לערבב כראוי ובעקביות את הריק בכל הדגימות ולאפשר זמני דגירה שווים עבור הריק בכל הדגימות. שברי חלבון בעלי עניין מיוחד יכולים להיות מנותחים עוד יותר עם ספקטרומטריית ספיגה אטומית או ICPMS כדי לאשר זיהום מתכת ולבדוק יונים מתכת חלבון chelated או קשור בחוזקה.
מלבד זיהוי קשירת מתכות מעבר, טכניקה זו יכולה לשמש למדידת זיקה מחייבת ליוני מתכת מעבר לחלבונים. HNB וכל ניקל נוכח דגימות הם מגרים לעיניים ולעור בהתאמה. PPE סטנדרטי כולל כפפות והגנה על העיניים יש להשתמש במהלך השיטה.
