يوفر هذا البروتوكول الخطوط التفصيلية لكيفية المشاركة في زراعة الخلايا الجذعية لب الأسنان مع الخلايا العصبية ثلاثية التوائم. مع ذلك ، يمكننا التحقيق في ردود متعددة مدفوعة بتوكهم المتبادل. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي القدرة على دراسة ومعالجة أي من مجموعات الخلايا أو كليهما وقياس النتائج بدقة.
هذه الطريقة لها صلة مباشرة بالبحوث العصبية ويمكن أن توفر نظرة ثاقبة في البحوث حول كيفية إصلاح الخلايا الجذعية لب الأسنان الأنسجة العصبية التالفة من الأحداث المؤلمة أو الأمراض العصبية. هناك عدة مراحل من هذه التقنية للتعلم ويمكن أن يكون من الصعب الحفاظ على قطعة من كل منهم. هذا البروتوكول تفاصيل كل مرحلة للمساعدة في ذلك.
من الصعب تفريق لب الأسنان و ganglia وتتطلب دوامة مختلفة و pipetting. حتى ذلك الحين سوف لا تحصل على التشتت الكامل حتى التحسين والتكرار سوف تكون هناك حاجة. بعد القتل الرحيم من الماوس، ووضع الرأس على underpad المتاح بحيث الفم هو نحو السقف وقاعدة الرقبة مسطحة على سطح العمل.
استخدم شفرة حلاقة حركة منشارة لفصل الفكي عن الفك العلوي. إزالة اللسان مع مقص أو ملقط للسماح الوصول إلى الأضراس أسهل. ضع الرأس المفتوح في الطبق فوق وسادة شاش معقمة ووضع العينة تحت المجهر التشريحي.
إزالة الأنسجة العظمية السنخية المحيطة الأضراس الأولى. إدراج ملقط في فتحة السنخية وندف الأنسجة بعيدا عن الأسنان نحو جانب بوكلي أو اللغة من الفم. جمع جميع الأضراس الفك العلوي الأول ونقل بلطف الأضراس الأولى submandibular وmaxillary إلى طبق ثقافة الخلية منفصلة مع 1X PBS على الجليد.
إزالة الجهاز الخارجي المينا المحيطة خارج كل الضرس الفكي الأول. مع مجموعة من ملقط تدوير الضرس بحيث cusps هي أسفل ويتم كشف الجذر المفتوح. هناك فتحة بيضاوية على الجزء السفلي من أنسجة لب الأسنان المبهمة والمعتمة مغلفة بطبقة رقيقة من العاج والمينا.
باستخدام طرف من ملقط، وتخفيف بلطف لب الأسنان عن طريق تشغيل ذراع واحدة من ملقط حول محيط الداخلية من الأنسجة المعدنية. إزالة أنسجة لب الأسنان من الهيكل الممعدن ونقلها إلى طبق ثالث يحتوي على 1X PBS. إزالة الجهاز الخارجي المينا إذا لم يكن بالفعل فصل.
نقل جميع أنسجة لب الأسنان إلى 0.25٪ التربسين EDTA في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. دوامة الخليط ووضعها في 37 درجة مئوية حمام الماء الدافئ لمدة 10 دقائق. تحت غطاء معقمة، إضافة وسائل الإعلام المشتركة الدافئة إلى نسبة نهائية من واحد إلى واحد على الأقل وسائل الإعلام إلى التربسين لإلغاء تنشيط الإنزيم.
Pipet وسائل الإعلام صعودا وهبوطا عدة مرات مع pipet 10 ملليلتر لمزيد من تفريق لب الأسنان في وسائل الإعلام، وتجنب فقاعات كبيرة. نقل ملليلتر واحد من لب الأسنان مشتتة إلى كل بئر من 24 بئرا لوحة الأنسجة. ضع الطبق في حاضنة عند درجة 37 مئوية.
وتسمح للخلايا بإرفاق وهجرة من الأنسجة غير المُجرّفة لمدة 48 ساعة قبل تغيير الوسائط. بعد القتل الرحيم وإزالة الجلد، إدراج غيض من زوج من مقص تشريح الدقيقة في قاعدة الجمجمة. قطع على طول خياطة القوس من الجمجمة.
جعل أربعة تخفيضات أفقية صغيرة على طول الغرز التاجية من الأذنين حتى على طول الغرز لامدويد من قاعدة الجمجمة. هذا يخلق اثنين من اللوحات من العظام. استخدام ملقط لقشر مرة أخرى اثنين من اللوحات من العظام للكشف عن الدماغ.
تحديد موقع ganglia ثلاثية التوائم التي تقع في ماتر دورا بين الدماغ والعظام من عملية الفك العلوي. قطع الفروع الثلاثة التي تسافر إلى العينين، وماكسيلا، وفك الفك. واستخدام ملقط حافة مستقيمة لنقل ganglia إلى PBS 1X الباردة في طبق على الجليد.
مرة واحدة يتم حصادها جميع حزم ثلاثية التوائم استخدام ملقط ملف لنقل ganglia إلى 50 ملليلتر أنبوب مخروطي يحتوي على خمسة ملليغرام لكل ملليلتر من نوع الكولاجين المصفى العقيمة II.Vortex الخليط ووضع الأنبوب في حمام الماء 37 درجة مئوية لمدة 25 إلى 30 دقيقة. كل خمس إلى عشر دقائق، أخرج الأنبوب من الحمام المائي، دوامة، والعودة إلى الحمام. الطرد المركزي الحل الخلايا العصبية ثلاثية التوائم الكولاجين لمدة دقيقتين في 643xg.
تحت غطاء محرك السيارة ثقافة الأنسجة، وpire بلطف collagenase مع micropipet وإضافة خمسة ملليلتر من 1٪ معقم تنقية نوع II.Then وضع الأنبوب في حمام الماء 37 درجة مئوية لمدة 25 إلى 30 دقيقة وخلال هذا الإطار الزمني دوامة الأنبوب لفترة وجيزة كل خمس دقائق. إضافة وسائط بنسبة واحد إلى واحد من التربسين إلى الوسائط لإلغاء تنشيط التبسين المتبقي. عد عدد الخلايا وتمييع الخليط إلى 200، 000 خلية لكل ملليلتر في وسائل الإعلام.
ضع مرشحات ترانسويل مغلفة في الآبار مع لب الأسنان. Pipet 250 ميكرولتر على مرشح transwell والثقافة الخلايا في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، استبدل وسائل الإعلام بميليلتر واحد من وسائل الإعلام المشاركة في الثقافة المكملة مع أوريدين ميكرومولار واحد و 15 ميكرومولار 5-Fluoro-2'deoxyuridine لوقف الانتشار المفرط للخلايا المتوسطة التي قد تمنع نوريتوث.
يجب إضافة مثبطات الميتوتيك في اليوم الثاني أو لن يحدث نمو نيوريت. في هذه الدراسة، تم زيادة نمو ثلاثي التوائم النوري في وجود خلايا لب الأسنان الأولية في البئر الأساسي مقارنة بالسيطرة على تربية أحادية ثلاثية التوائم. وكانت الخلايا الأولية المعزولة من مستقبلات TGF-beta 2 flox/ flox الماوس ما يعادل في عدد بعد حقن إما ade-Cre-GFP أو ade-eGFP.
PCR شبه كمية يوضح أن adenovirus-Cre-GFP حذف الجينات يحيط تحويل مستقبلات بيتا عامل النمو 2 مع adenovirus-eGFP بمثابة ناقل الفيروسية مكافحة. في الثقافات مع تحويل عامل النمو مستقبلات بيتا 2 الحذف، انخفض نوريت outgrowth. التصوير في المجال الساطع من مرشحات ترانسويل بعد تلطيخ البنفسجية البلورية من مجموعات الخلايا يظهر أن المسام الكبيرة هي السائدة.
يشير السهم الكبير إلى خلية مع مورفولوجيا mesenchymal في حين يشير السهم الصغير إلى خلية من مورفولوجيا الخلايا العصبية. اللون البنفسجي الكريستال كلا الخلايا دون تحيز. بالإضافة إلى ذلك ، يظهر تلطيخ الفلوروس المناعي من توبيولين بيتا-3 مع جسم مضاد ثانوي alexa 488 تلطيخ غير محدد للخلايا المتعددة مما يجعل تصوير الهياكل afferent صعبًا.
لأن لا خلايا لب الأسنان ولا الخلايا العصبية ثلاثية التوائم تفريق بسهولة، كل باحث سوف تحتاج إلى تحسين إجراءاتها الطلاء. إذا كنت زراعة خلايا لب الأسنان وحدها في آبار منفصلة يمكنك استخدام immunofluorescence أو يمكنك تحديد الحمض النووي الريبي أو مستويات البروتين لتحديد كيفية استجابة خلايا لب الأسنان إلى الخلايا العصبية. تذكر أن تبيض أي حاويات أو نصائح التي تأتي في اتصال مع الفيروس الغدي.
تأكد من التخلص من شفرات الحلاقة بشكل صحيح في سلة حادة.
