Bu protokol trigeminal nöronlar ile birlikte diş hamuru kök hücreleri nasıl co-kültür ayrıntılı anahat sağlar. Bununla, onların çapraz konuşmaları tarafından yönlendirilen birden fazla yanıtı araştırabiliriz. Bu tekniğin en büyük avantajı, hücre popülasyonlarını veya her ikisini de inceleyip manipüle edebilme ve sonuçları tam olarak ölçebilme yeteneğidir.
Bu yöntem nöral araştırmalara doğrudan ilgi vardır ve diş posası kök hücrelerinin travmatik olaylar veya nörodejeneratif hastalıklardan zarar gören nöral dokuları nasıl onardığı üzerine araştırmalara ışık verebilir. Bu tekniğin öğrenmesi gereken birkaç aşama vardır ve hepsini uzak tutmak zor olabilir. Bu protokol bu işe yardımcı olmak için her aşamayı ayrıntılarıyla anlatır.
Diş hamuru ve ganglia dağıtmak zordur ve çeşitli girdap ve pipetleme gerektirir. O zaman bile optimizasyon ve çoğaltma gerekli olacak bu yüzden tam dağılım almasanız. Farenin ötenazisinden sonra, ağzı tavana doğru ve boyun tabanı çalışma yüzeyinde düz olacak şekilde tek kullanımlık alt lık üzerine baş yerleştirin.
Mandibulayı maksilladan ayırmak için jilet ve testere hareketi kullanın. Azı dlarına daha kolay erişim sağlamak için dili makasla veya çömleğiyle çıkarın. Açık başı steril bir gazlı bez yastığının üzerine tabağa yerleştirin ve numuneyi diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin.
İlk azı döşeylerini çevreleyen alveoler kemik dokusunu çıkarın. Alveolar açılım içine forceps yerleştirin ve ağız buccle veya lingual tarafına doğru diş uzak doku kızdırmak. Tüm maksiller ilk azı makinelerini toplayın ve submandibular ve maksiller ilk azı makinelerini buz üzerinde 1X PBS ile ayrı bir hücre kültür yemeğine nazikçe aktarın.
Her maksiller ilk azı dışında çevreleyen mine dış organ çıkarın. Bir set ile molar döndürün, böylece ponp'lar aşağı ve açık kök açığa çıkar. Dişin alt kısmında oval bir açıklık ve ince bir dentin ve mine tabakası ile kapsüllenmiş opak diş hamuru dokusu var.
Forceps ucu kullanarak, yavaşça mineralize doku iç çevresi etrafında forceps bir kol çalıştırarak diş posası gevşetin. Diş posası dokusunu mineralize yapıdan çıkarın ve 1X PBS içeren üçüncü bir tabağa aktarın. Emaye dış organını zaten ayrılmamışsa çıkarın.
50 mililitrelik konik tüpte tüm diş posa dokusunu %0.25 tripsin EDTA'ya aktarın. Karışımı girdap ve 10 dakika boyunca 37 derece santigrat derece ılık su banyosu yerleştirin. Steril bir başlık altında, enzim inaktive etmek için trypsin için en az bire bir medya son oranına ısıtılmış co-kültür medya ekleyin.
Daha fazla medya diş hamuru dağıtmak için 10 mililitrelik pipet ile medya yukarı ve aşağı birden fazla kez pipet, büyük kabarcıklar kaçının. 24-iyi doku kültür plaka her kuyuya dağınık diş hamuru bir mililitre aktarın. Plakayı 37 derece santigrat derecede bir kuvöze yerleştirin.
Ve hücrelerin ortam değiştirmeden önce 48 saat boyunca dağılmayan dokuya takılmasına ve dışarı çıkmasına izin verin. Ötenazi ve deri çıkarıldıktan sonra, kafatası tabanına mikro diseksiyon makas bir çift ucu ekleyin. Kafatasının sagittal sütür boyunca kesilmiş.
Kafatası tabanının lambdoid dikişleri boyunca kulakları tarafından koronal dikişboyunca dört küçük yatay kesim olun. Bu iki kemik flebi oluşturur. Beyni ortaya çıkarmak için iki kemik kapağını soymak için püzüler kullanın.
Beyin ve maksiller sürecin kemik arasındaki dura mater içinde ev trigeminal ganglia bulun. Gözlere, maksillaya ve çene ye doğru giden üç dalı kesin. Ve buz üzerinde bir tabakta soğuk 1X PBS ganglia aktarmak için düz kenar ince forceps kullanın.
Tüm trigeminal demetleri hasat edildikten sonra steril filtreli kollajenaz tip II.Vortex karışımı mililitre başına beş miligram içeren 50 mililitre konik tüp ganglia aktarmak için dosya forseps kullanın ve 25 ila 30 dakika boyunca 37 derece Santigrat su banyosu tüp yerleştirin. Her 5-10 dakikada bir tüpü su banyosundan, girdaptan çıkar ve banyoya geri dön. 643xg iki dakika kollajenaz trigeminal nöron çözeltisi santrifüj.
Bir doku kültürü başlık altında, yavaşça bir mikropipet ile kollajenaz aspire ve% 1 steril filtreli tripsin tip II beş mililitre ekleyin.Sonra 25 ila 30 dakika için 37 derece santigrat su banyosu içine tüp yerleştirin ve bu zaman dilimi içinde kısa bir süre her beş dakikada tüp girdap. Kalan trypsin'i devre dışı bırakmak için ortama bire bir tripsin oranında ortam ekleyin. Hücre sayısını sayın ve karışımı medyada mililitre başına 200,000 hücreye seyreltin.
Diş hamuru ile kuyular içine kaplı transwell filtreler yerleştirin. Pipet 250 mikrolitre transwell filtre üzerine ve kültür hücreleri 37 derece santigrat bir gecede. Ertesi gün, bir mikromolar uridin ve 15 mikromolar 5-Fluoro-2'deoksiuridine ile takviye co-kültür medya bir mililitre ile medya değiştirin neurit büyümesini önleyebilir mezenkimal hücrelerin aşırı çoğalmasını durdurmak için.
İkinci günde mitotik inhibitörler eklemeniz gerekir veya neurite büyüme meydana gelmez. Bu çalışmada, trigeminal nörit monokültür kontrolü ile karşılaştırıldığında altta yatan altta primer diş posa hücrelerinin varlığında trigeminal neurite büyüme artmıştır. TGF-beta reseptör 2 flox/flox fareden izole edilen primer hücreler ade-Cre-GFP veya ade-eGFP enjeksiyonlarından sonra sayıca eşdeğerdi.
Yarı kantitatif PCR adenovirüs-Cre-GFP bir kontrol viral vektör olarak hizmet adenovirüs-eGFP ile büyüme faktörü beta reseptör 2 dönüştüren kanatlı gen sildi göstermektedir. Dönüşüm faktörü beta reseptör 2 deletion ile kültürlerde, neurite outgrowth azalmıştır. Hücre popülasyonlarının kristal mor boyamadan sonra transwell filtrelerinin parlak alan görüntülemesi büyük gözeneklerin yaygın olduğunu göstermektedir.
Büyük ok mezenkimal morfolojisi olan bir hücreyi işaret ederken, küçük ok nöronal morfolojinin bir hücresini işaret ederken. Kristal menekşe önyargısız her iki hücrelekeli. Buna ek olarak, beta-III tubulin in bir alexa 488 ikincil antikor ile immünofloresan boyama afferent yapıların görüntüleme zor hale birden fazla hücrenonspesifik olmayan boyama gösterir.
Ne diş hamuru hücreleri ne de trigeminal nöronlar kolayca dağıtmak için, her araştırmacı kendi kaplama prosedürleri optimize etmek gerekir. Eğer kültür diş hamuru hücreleri tek başına ayrı kuyularda immünoresans kullanabilirsiniz veya diş hamuru hücreleri nöronlara nasıl yanıt olduğunu belirlemek için RNA veya protein düzeylerini ölçebilirsiniz. Adenovirüs ile temas eden kapları veya ipuçlarını beyazlatmaya unutmayın.
Keskin bir çöp kutusuna düzgün jilet atmak için emin olun.
