该协议提供了如何与三叉神经元共同培养牙髓干细胞的详细大纲。有了它，我们可以调查由他们的相声驱动的多个响应。这种技术的主要优点是能够研究和操作细胞群体之一或两个细胞群，并精确测量结果。
这种方法与神经研究有直接关系，可以深入了解牙髓干细胞如何修复创伤性事件或神经退行性疾病受损的神经组织。这种技术有几个阶段要学习，很难把它们全部保留一些。该协议详细介绍了每个阶段，以帮助这一点。
牙髓和牙髓难以分散，需要各种涡流和移液。即使这样，您也无法获得完全分散，因此需要优化和复制。对鼠标实施安乐死后，将头部放在一次性垫上，使嘴朝向天花板，颈部底座平放在工作表面上。
使用剃须刀刀片和锯切运动将毛细剑与 maxilla 分开。用剪刀或钳子去除舌头，以便更容易地接触摩尔。将开放的头放在无菌纱布垫上的盘子中，将试样放在解剖显微镜下。
取出第一个摩尔周围的肺骨组织。将钳子插入肺泡开口，将组织从牙齿转向嘴上的水桶或语言侧。收集所有最大第一摩尔，并轻轻地将亚曼地和最大摩尔转移到一个单独的细胞培养皿与1X PBS在冰上。
去除每个大摩尔外侧周围的釉质外器官。使用一组钳子旋转摩尔，使尖子向下，打开的根被公开。牙齿底部有一个椭圆形开口，不透明的牙髓组织被薄薄的牙龈和牙釉质层封装。
使用钳子的尖端，通过围绕矿化组织的内部周长运行一臂钳，轻轻松开牙髓。从矿化结构中去除牙髓组织，转移到含有 1X PBS 的第三个培养皿中。如果釉质外器官尚未分离，请将其取出。
在 50 毫升锥形管中将所有牙髓组织转移到 0.25% 的 trypsin EDTA 中。漩涡混合物，并放在一个37摄氏度的温水浴10分钟。在无菌罩下，将加热的共培养基介质添加到至少一对一介质的最终比例中，以尝试性酶来灭活酶。
用10毫升移液器多次上下移料，以进一步分散介质中的牙髓，避免出现大气泡。将分散的牙髓的一毫升转移到24井组织培养板的每个井中。将板放在摄氏37度的培养箱中。
并允许细胞在改变介质之前，从未分散的组织上连接并迁移48小时。安乐死和去除皮肤后，将一把微型解剖剪刀的尖端插入头骨底部。沿着头骨的缝合线切割。
使四个小的水平切口沿冠状缝合线的耳朵，直到沿着头骨底部的羔羊缝合线。这将创建两个骨瓣。用钳子剥回两个骨瓣，露出大脑。
找到位于大脑和骨骼之间的三叉神经。切开三根树枝，这些树枝会向眼睛、最大和毛细血管中游去。并使用直边细钳将刚将钢联转移到冰盘上的冷 1X PBS。
一旦收获所有三叉束使用文件钳将刚龙转移到50毫升锥形管，每毫升含有5毫克的无菌过滤胶原酶II.Vortex混合物，将管放在37摄氏度的水浴中25至30分钟。每五到十分钟，把管子从水浴中拿出来，漩涡，然后回到浴池里。在643xg下将胶原酶三叉神经元溶液离心两分钟。
在组织培养罩下，用微管轻轻吸吸胶原酶，加入5毫升1%无菌过滤的三普辛II型，然后将管子放入37摄氏度的水浴中25至30分钟，并在这段时间内每隔5分钟短暂旋转一次管。以 trypsin 与介质的一对一比例添加媒体，以停用剩余的 trypsin。计算细胞数量，在介质中稀释混合物至每毫升20万个细胞。
将涂层的转井过滤器放入带牙髓的井中。将250微升的移液器放到转井过滤器上，并在37摄氏度的温度下培养细胞。第二天，用一毫升共培养基介质代替介质，辅以一微摩尔尿素和15微摩尔5-氟-2'脱氧核糖核酸，以阻止可能防止神经性细胞生长的间质细胞过度增殖。
你必须添加线粒体抑制剂的第二天或神经素生长不会发生。在这项研究中，与控制三叉神经性单培养相比，在底层井中存在原生牙髓细胞时，三叉神经土的生长增加。从TGF-beta受体2浮子/flox小鼠分离的原细胞在注射ade-Cre-GFP或ade-eGFP后数量相等。
半定量PCR表明，腺病毒-Cre-GFP删除了侧翼基因转化生长因子β受体2，腺病毒eGFP作为控制病毒载体。在生长因子转化β受体2缺失的培养中，神经素的外生长量减少。细胞群在晶体紫罗兰染色后对透井过滤器进行亮场成像，表明大孔隙普遍存在。
大箭头指向具有中质形态的细胞，而小箭头指向神经元形态的细胞。水晶紫罗兰没有偏置地染色了两个细胞。此外，使用alex488二级抗体的β-III管状细胞的免疫荧光染色显示多个细胞的非特异性染色，使得对外向结构的成像变得困难。
因为牙髓细胞和三叉神经元都不易分散，所以每个研究人员都需要优化他们的电镀程序。如果您单独在单独的井中培养牙髓细胞，您可以使用免疫荧光，或者您可以量化RNA或蛋白质水平，以确定牙髓细胞对神经元的反应。记得漂白任何与腺病毒接触的容器或提示。
一定要把剃须刀正确丢弃在锋利的垃圾箱里。
