هذا البروتوكول هو النظام الذاتي لثقافة الخلايا الليفية البشرية مع البلازما الغنية بالصفائح الدموية الخاصة بالمريض وإعداد موحد لمدة خمس دقائق. PRP يعزز التوسع الهائل للخلايا الليفية في الثقافة. أوصيك باستخدام هذه الطريقة باستخدام PRP كمكمل خلوي عندما تحتاج إلى توسع هائل وآمن للخلايا لعلاجات الخلايا الذاتية.
عند محاولة هذا البروتوكول ، أوصيك بالتحقق من سلامة PRP. يجب أن تكون البلازما نظيفة جدا مع عدم وجود خلايا الدم الحمراء. عند نقله ، عليك القيام بذلك بعناية فائقة.
وفيما يتعلق بهضم أنسجتك ، يجب أن تكون نظيفة جدا قبل المتابعة. للبدء ، اقلب بعناية أنابيب البلازما الغنية بالصفائح الدموية المملوءة بالدم ، أو PRP ، رأسا على عقب ثلاث مرات لخلط الدم مع مضادات التخثر. أجهزة الطرد المركزي عينات الدم في 1500g لمدة خمس دقائق في دوار ثابت بزاوية 45 درجة وموازنة الأنابيب.
بعد الطرد المركزي ، يحتوي الدم المجزأ على خلايا دم حمراء وبيضاء محاصرة تحت الهلام الفاصل والصفائح الدموية على سطح الجل. اقلب أنبوب PRP برفق 20 مرة لإعادة تعليق رواسب الصفائح الدموية في طاف البلازما. تأكد من فصل الصفائح الدموية تماما عن الجل ويجب أن تتغير البلازما من شفافة وشفافة إلى عكرة.
اجمع محلول البلازما من الأنبوب باستخدام جهاز نقل متصل بحقنة سعة 10 ملليلتر. ضع عينات الجلد في أنبوب بولي بروبيلين سعة 50 ملليلتر مع برنامج تلفزيوني وهز الأنبوب برفق. إذا كانت عينة الجلد كبيرة نسبيا، فضعها على غطاء طبق زراعة الأنسجة الذي تبلغ مساحته 150 سنتيمترا مربعا بحيث يكون جانب البشرة لأسفل.
إزالة الأنسجة الدهنية تحت الجلد باستخدام زوج من ملقط ومقص. لمنع الأنسجة من الجفاف ، اشطف المنديل كل بضع دقائق في برنامج تلفزيوني. عند اكتمال إزالة الدهون ، استخدم مشرطا لتقطيع عينات الجلد إلى شرائح ، حوالي 0.5 × 1.5 سم.
بعد ذلك ، أضف خمسة ملليلتر من مزيج الكولاجين / ديسباز إلى أنبوب معقم سعة 15 ملليلتر. نقل الأنسجة المقطوعة إلى الأنبوب. تأكد من غمر قطع الأنسجة في المحلول وقم بتغطية الأنبوب بإحكام.
ضع الأنابيب في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز المداري لمدة 150 دقيقة. بعد الحضانة ، انقل الأنبوب الذي يحتوي على الأنسجة إلى خزانة السلامة الحيوية. ضع غطاء طبق استزراع معقم 100 ملم رأسا على عقب في خزانة السلامة البيولوجية.
نقل تعليق الأنسجة إلى أسفل طبق الثقافة 100 ملم دون رش. إذا بقيت أي قطع من الأنسجة في الأنبوب ، فاستخدم ماصة معقمة سعة ملليلتر واحد أو ملقط معقم لنقل القطع إلى قاع طبق الاستزراع. مع توجيه البشرة لأعلى ، امسك الأدمة بزوج من الملقط.
أمسك حافة البشرة بزوج آخر من الملقط وقشر الأدمة والبشرة بعيدا. مع الحفاظ على القطع المنفصلة على نفس الغطاء ، ضع القطع الجلدية في طبق استزراع جديد 100 ملم يحتوي على برنامج تلفزيوني. بعد ذلك ، باستخدام ملقط المختبر ، انقل القطع الجلدية إلى أنبوب بولي بروبيلين سعة 15 ملليلتر يحتوي على ثلاثة ملليلتر من 0.3٪ Trypsin PBS.
احتضن الأنبوب في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية واخلط المحتويات كل دقيقتين إلى ثلاث دقائق عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات. بعد 10 إلى 20 دقيقة ، أوقف التفاعل بإضافة ثلاثة إلى خمسة ملليلتر من وسط النمو الكامل المثلج البارد. دوامة الأنبوب بقوة عدة مرات.
قم بتصفية التعليق ، الذي يحتوي على الخلايا الليفية ، من خلال شبكة نايلون 85 ميكرون في أنبوب سعة 50 ملليلتر. الطرد المركزي محلول الخلايا الليفية في 150g لمدة 10 دقائق. نضح المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 100 إلى 200 ميكرولتر من وسط النمو الكامل لعدد الخلايا.
ضع الخلايا في دورق زراعة الأنسجة الذي تبلغ مساحته 25 سنتيمترا مربعا. ثم احتضان القارورة عند 37 درجة سلزية. قم بتغيير الوسط الذي يحتوي على خلايا غير ملتصقة في اليوم التالي ، ومرة أخرى ، كل ثلاثة إلى أربعة أيام.
عندما تصل الخلايا الليفية إلى التقاء 70 إلى 80٪ ، اغسلها باستخدام برنامج تلفزيوني وأضف محلول Trypsin-EDTA. بعد احتضان القارورة لمدة ثلاث دقائق عند 37 درجة سلزية، أوقف التفاعل بإضافة ثلاثة إلى خمسة ملليلترات من وسط النمو الكامل الدافئ. ثم ، الطرد المركزي تعليق الخلية في 200g لمدة خمس دقائق.
إزالة طاف عن طريق الشفط. استزرع الخلايا الليفية في وسط PRP واحتضانها عند 37 درجة مئوية. الحد الأدنى لكثافة الخلايا الموصى بها هو 4،000 خلية قابلة للحياة لكل سنتيمتر مربع.
تم استخدام جهاز طبي مخصص لإنتاج PRP عن طريق معالجة الدم الكامل من 10 مرضى مختلفين. أزال الجهاز غالبية خلايا الدم الحمراء وخلايا الدم البيضاء. كان متوسط تركيز الصفائح الدموية في PRP أعلى بنسبة 50٪ تقريبا من تركيز الصفائح الدموية في الدم الكامل.
تمت زراعة الخلايا الليفية الذاتية في وسط يحتوي على 10٪ FBS أو في وسائط بتركيزات PRP تتراوح من واحد إلى 50٪ بعد سبعة أيام من الثقافة ، دون تغيير الوسط ، أظهرت الثقافات المحضرة ب 20٪ PRP عددا أكبر من الخلايا الليفية القابلة للحياة. كان ل PRP تأثيرات قوية كمعزز للانتشار يصل إلى 7.7 أضعاف مقارنة ب FBS. أظهر تلطيخ Phalloidin أن التغيير المورفولوجي الذي لوحظ عند تنشيط PRP كان مرتبطا بإعادة تنظيم F-actin ، وهو توقيع على تنشيط الخلايا الليفية.
أحد المخاوف الرئيسية للتوسع السريع للخلايا هو خطر التعديل الجينومي. من أجل تقييم ذلك ، يمكنك إجراء مقايسة التهجين الجينومي المقارن لتقييم الاستقرار الجيني لخلاياك. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي استبدال FBS ب PRP ، وهو مكمل بيولوجي ذاتي أكثر قوة.
مع هذا ، يمكن للباحث أن ينمو المزيد من الخلايا بشكل أسرع دون أي إضافة لمواد أجنبية. قد نستخدم هذه التقنية لأنواع الخلايا الأخرى التي تحتاج إلى توسيع خارج الجسم الحي قبل التطبيق السريري ، على سبيل المثال ، الخلايا الكيراتينية أو الخلايا الجذعية الوسيطة.
