生产自体富血小板血浆以促进体外人成纤维细胞扩增

该方案是用于人成纤维细胞培养的自体系统，使用患者自己的富血小板血浆和五分钟的标准化制剂。PRP促进培养中成纤维细胞的大量细胞扩增。我建议您使用这种方法使用PRP作为细胞补充剂，当您需要大量的小溪和安全的细胞扩增进行自体细胞治疗时。

当您尝试此协议时，我建议您检查PRP完整性。您的血浆必须非常干净，没有红细胞。当你转移它时，你必须非常小心地做。

关于组织的消化，在继续之前必须非常干净。首先，小心地将充满血液的富血小板血浆（PRP）管倒置三次，以将血液与抗凝剂混合。在固定的 45 度角转子中以 1500g 离心血液样品五分钟并平衡试管。

离心后，分离的血液在分离凝胶下捕获红细胞和白细胞，凝胶表面有血小板。轻轻倒置PRP管20次，将血小板沉积物重悬于血浆上清液中。确保血小板与凝胶完全分离，血浆应从透明变为浑浊。

使用连接到10毫升注射器的转移装置从管中收集血浆溶液。将皮肤样品放入装有PBS的50毫升聚丙烯管中，轻轻摇动试管。如果皮肤样本相对较大，请将其放在 150 平方厘米的组织培养皿的盖子上，表皮面朝下。

用一把镊子和剪刀取出皮下脂肪组织。为防止纸巾变干，请每隔几分钟在PBS中冲洗一次纸巾。脂肪去除完成后，使用手术刀将皮肤样本切成大约 0.5 x 1.5 厘米的条状。

接下来，将 5 毫升胶原酶/分散酶混合物添加到无菌 15 毫升管中。将切割的组织转移到管中。确保将组织碎片浸没在溶液中并牢固地盖住试管。

将试管放入37摄氏度的培养箱中，轨道振荡150分钟。孵育后，将装有组织的管移动到生物安全柜中。将无菌100毫米培养皿的盖子倒置在生物安全柜中。

将组织悬浮液转移到100毫米培养皿的底部，不要飞溅。如果试管中残留任何组织碎片，请使用无菌的一毫升移液管或无菌镊子将碎片转移到培养皿底部。表皮朝上，用一对镊子握住真皮。

用另一对镊子抓住表皮的边缘，将真皮和表皮分开。将分离的碎片放在同一个盖子上，将真皮碎片放入含有PBS的新100毫米培养皿中。接下来，使用实验室镊子将真皮片转移到含有三毫升0.3%胰蛋白酶PBS的15毫升聚丙烯管中。

将试管在 37 摄氏度的水浴中孵育，并通过倒置试管几次每两到三分钟混合一次内容物。10至20分钟后，加入三至五毫升冰冷的完全生长培养基停止反应。用力涡旋管子几次。

将含有成纤维细胞的悬浮液通过85微米尼龙网过滤到50毫升管中。将成纤维细胞溶液以150g离心10分钟。吸出上清液并将细胞沉淀重悬于100至200微升完全生长培养基中以进行细胞计数。

将细胞接种在25平方厘米的组织培养瓶中。然后，将烧瓶在 37 摄氏度下孵育。第二天更换含有非贴壁细胞的培养基，每三到四天更换一次。

当成纤维细胞达到70%至80%汇合度时，用PBS洗涤并加入胰蛋白酶-EDTA溶液。将烧瓶在37摄氏度下孵育三分钟后，加入三至五毫升温热的完全生长培养基停止反应。然后，将细胞悬液以200g离心五分钟。

抽吸除去上清液。在PRP培养基中培养成纤维细胞并在37摄氏度下孵育。推荐的最小细胞密度为每平方厘米4， 000个活细胞。

专用医疗设备用于通过处理来自10名不同患者的全血来产生PRP。该装置去除了大部分红细胞和白细胞。PRP中的平均血小板浓度比全血中的血小板浓度高约50%。

自体成纤维细胞在含有10%FBS的培养基或PRP浓度范围为1至50%的培养基中培养7天后，在不改变培养基的情况下，用20%PRP引发的培养物表现出更多数量的活成纤维细胞。与FBS相比，PRP作为增殖助推器具有高达7.7倍的有效效果。鬼笔环肽染色显示，PRP活化时观察到的形态变化与F-肌动蛋白重组有关，F-肌动蛋白重组是成纤维细胞活化的标志。

快速细胞扩增的一个主要问题是基因组修饰的风险。为了评估这一点，您可以进行比较基因组杂交测定以评估细胞的基因组稳定性。该技术的主要优点是用PRP代替FBS，PRP是一种更有效的自体生物补充剂。

有了这个，研究人员可以在不添加任何异种物质的情况下更快地生长更多的细胞。我们可以将这种技术用于临床应用前需要离体扩增的其他细胞类型，例如角质形成细胞或间充质干细胞。