Questo protocollo è il sistema autologo per la coltura di fibroblasti umani con plasma ricco di piastrine del paziente e una preparazione standardizzata per cinque minuti. Il PRP promuove una massiccia espansione cellulare dei fibroblasti in coltura. Ti consiglierei di utilizzare questo metodo usando il PRP come integratore cellulare quando hai bisogno di un torrente massiccio e di un'espansione cellulare sicura per le terapie cellulari autologhe.
Quando si tenta questo protocollo, si consiglia di verificare l'integrità del PRP. Il plasma deve essere molto pulito con assenza di globuli rossi. Quando lo trasferisci, devi farlo con molta attenzione.
E per quanto riguarda la digestione del tessuto, deve essere molto pulito prima di procedere. Per iniziare, capovolgere con attenzione i tubi di plasma ricco di piastrine pieni di sangue, o PRP, tre volte per mescolare il sangue con l'anticoagulante. Centrifugare i campioni di sangue a 1500 g per cinque minuti in un rotore fisso ad angolo di 45 gradi e bilanciare i tubi.
Dopo la centrifugazione, il sangue frazionato ha globuli rossi e bianchi intrappolati sotto il gel separatore e piastrine sulla superficie del gel. Capovolgere delicatamente il tubo PRP 20 volte per risospendere il deposito piastrinico nel surnatante plasmatico. Assicurarsi che le piastrine siano completamente staccate dal gel e che il plasma cambi da trasparente e torbido.
Raccogliere la soluzione al plasma dal tubo utilizzando un dispositivo di trasferimento collegato a una siringa da 10 millilitri. Posizionare i campioni di pelle in un tubo di polipropilene da 50 millilitri con PBS e agitare delicatamente il tubo. Se il campione di pelle è relativamente grande, posizionarlo sul coperchio di un piatto di coltura tissutale di 150 centimetri quadrati con il lato epidermico verso il basso.
Rimuovere il tessuto adiposo sottocutaneo usando un paio di pinze e forbici. Per evitare che il tessuto si secchi, sciacquare il tessuto ogni pochi minuti in PBS. Quando la rimozione del grasso è completa, utilizzare un bisturi per tagliare i campioni di pelle in strisce, circa 0,5 per 1,5 centimetri.
Quindi, aggiungere cinque millilitri di miscela di collagenasi / dispase a un tubo sterile da 15 millilitri. Trasferire il tessuto tagliato nel tubo. Assicurarsi che i pezzi di tessuto siano immersi nella soluzione e tappare saldamente il tubo.
Posizionare i tubi in un'incubatrice a 37 gradi Celsius con agitazione orbitale per 150 minuti. Dopo l'incubazione, spostare il tubo contenente il tessuto nell'armadio di biosicurezza. Posizionare il coperchio di un piatto di coltura sterile da 100 millimetri capovolto nell'armadio di biosicurezza.
Trasferire la sospensione di tessuto sul fondo del piatto di coltura da 100 millimetri senza schizzi. Se rimangono pezzi di tessuto nel tubo, utilizzare una pipetta sterile da un millilitro o una pinza sterile per trasferire i pezzi sul fondo del piatto di coltura. Con l'epidermide rivolta verso l'alto, tenere il derma con un paio di pinze.
Afferrare il bordo dell'epidermide con un altro paio di pinze e staccare il derma e l'epidermide. Mantenendo i pezzi separati sullo stesso coperchio, posizionare i pezzi dermici in un nuovo piatto di coltura da 100 millimetri contenente PBS. Successivamente, utilizzando una pinza da laboratorio, trasferire i pezzi dermici in un tubo di polipropilene da 15 millilitri contenente tre millilitri di 0,3% di Trypsin PBS.
Incubare il tubo in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius e mescolare il contenuto ogni due o tre minuti invertendo il tubo più volte. Dopo 10-20 minuti, interrompere la reazione aggiungendo da tre a cinque millilitri di terreno di coltura completo ghiacciato. Vortice il tubo vigorosamente più volte.
Filtrare la sospensione, che contiene i fibroblasti, attraverso una rete di nylon da 85 micron in un tubo da 50 millilitri. Centrifugare la soluzione di fibroblasti a 150g per 10 minuti. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 100-200 microlitri di terreno di crescita completo per la conta cellulare.
Placcare le cellule in un pallone di coltura tissutale di 25 centimetri quadrati. Quindi, incubare il pallone a 37 gradi Celsius. Cambiare il mezzo che contiene cellule non aderenti il giorno seguente, e di nuovo, ogni tre o quattro giorni.
Quando i fibroblasti raggiungono il 70-80% di confluenza, lavarli con PBS e aggiungere la soluzione di tripsina-EDTA. Dopo aver incubato il pallone per tre minuti a 37 gradi Celsius, interrompere la reazione aggiungendo da tre a cinque millilitri di terreno di coltura completo caldo. Quindi, centrifugare la sospensione cellulare a 200 g per cinque minuti.
Rimuovere il surnatante per aspirazione. Coltura dei fibroblasti in mezzo PRP e incubazione a 37 gradi Celsius. La densità cellulare minima raccomandata è di 4.000 cellule vitali per centimetro quadrato.
Un dispositivo medico dedicato è stato utilizzato per produrre PRP elaborando sangue intero da 10 pazienti diversi. Il dispositivo ha rimosso la maggior parte dei globuli rossi e dei globuli bianchi. La concentrazione piastrinica media nel PRP era circa il 50% superiore alla concentrazione piastrinica nel sangue intero.
I fibroblasti autologhi sono stati coltivati in terreno con il 10% di FBS o in terreni con concentrazioni di PRP comprese tra uno e 50% Dopo sette giorni di coltura, senza cambiare il terreno, le colture innescate con il 20% di PRP hanno mostrato un numero maggiore di fibroblasti vitali. Il PRP ha avuto effetti potenti come booster di proliferazione fino a 7,7 volte rispetto all'FBS. La colorazione con falloidina ha mostrato che il cambiamento morfologico osservato all'attivazione del PRP era correlato alla riorganizzazione della F-actina, che è una firma dell'attivazione dei fibroblasti.
Una delle principali preoccupazioni della rapida espansione cellulare è il rischio di modificazione genomica. Per valutare questo, è possibile eseguire un test comparativo di ibridazione genomica per valutare la stabilità genomica delle cellule. Il vantaggio principale di questa tecnica è quello di sostituire FBS con un PRP, che è un integratore biologico autologo più potente.
Con questo, il ricercatore può far crescere più cellule più velocemente senza alcuna aggiunta di sostanze xenogeniche. Possiamo usare questa tecnica per altri tipi di cellule che necessitano di espansione ex vivo prima dell'applicazione clinica, ad esempio cheratinociti o cellule staminali mesenchimali.
