Этот протокол представляет собой аутологичную систему для культивирования фибробластов человека с собственной обогащенной тромбоцитами плазмой пациента и стандартизированным препаратом в течение пяти минут. PRP способствует массивной клеточной экспансии фибробластов в культуре. Я бы порекомендовал вам использовать этот метод с использованием PRP в качестве клеточной добавки, когда вам нужен массивный поток и безопасная клеточная экспансия для аутологичной клеточной терапии.
Когда вы попробуете этот протокол, я бы порекомендовал вам проверить целостность PRP. Ваша плазма должна быть очень чистой, с отсутствием эритроцитов. Когда вы переносите его, вы должны делать это очень осторожно.
Что касается переваривания вашей ткани, она должна быть очень чистой, прежде чем продолжить. Для начала осторожно переверните заполненную кровью плазму, богатую тромбоцитами, или PRP, пробирки вверх дном три раза, чтобы смешать кровь с антикоагулянтом. Центрифугируйте образцы крови весом 1500 г в течение пяти минут в фиксированном роторе под углом 45 градусов и балансируйте пробирки.
После центрифугирования фракционированная кровь имеет эритроциты и лейкоциты, попавшие под разделительный гель, и тромбоциты на поверхности геля. Осторожно инвертируйте PRP-пробирку 20 раз, чтобы ресуспендировать отложение тромбоцитов в надосадочной жидкости плазмы. Убедитесь, что тромбоциты полностью отделены от геля, а плазма должна измениться с прозрачной и прозрачной на мутную.
Соберите плазменный раствор из пробирки с помощью передаточного устройства, подключенного к 10-миллилитровому шприцу. Поместите образцы кожи в 50-миллилитровую полипропиленовую пробирку с PBS и осторожно встряхните пробирку. Если образец кожи относительно большой, поместите его на крышку чашки для культивирования тканей площадью 150 квадратных сантиметров эпидермальной стороной вниз.
Удалите подкожно-жировую клетчатку с помощью щипцов и ножниц. Чтобы предотвратить высыхание ткани, промывайте салфетку каждые несколько минут в PBS. Когда удаление жира будет завершено, используйте скальпель, чтобы разрезать образцы кожи на полоски примерно 0,5 на 1,5 сантиметра.
Затем добавьте пять миллилитров смеси коллагеназы и диспазы в стерильную 15-миллилитровую пробирку. Переложите разрезанную ткань в трубку. Убедитесь, что кусочки ткани погружены в раствор, и надежно закройте трубку.
Поместите пробирки в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия с орбитальным встряхиванием в течение 150 минут. После инкубации переместите пробирку, содержащую ткань, в шкаф биобезопасности. Поместите крышку стерильной 100-миллиметровой чашки для культур вверх дном в шкаф биобезопасности.
Перенесите тканевую суспензию на дно 100-миллиметровой чашки для культуры, не разбрызгивая. Если в пробирке остались какие-либо кусочки ткани, используйте стерильную пипетку объемом один миллилитр или стерильные щипцы, чтобы перенести кусочки на дно чашки для культуры. Эпидермисом вверх удерживайте дерму щипцами.
Возьмитесь за край эпидермиса другой парой щипцов и разделите дерму и эпидермис. Держа отделенные кусочки на одной крышке, поместите кожные кусочки в новую 100-миллиметровую культуральную чашку, содержащую PBS. Затем, используя лабораторные щипцы, перенесите кусочки кожи в 15-миллилитровую полипропиленовую пробирку, содержащую три миллилитра 0,3% трипсина PBS.
Инкубируйте пробирку на водяной бане с температурой 37 градусов Цельсия и перемешивайте содержимое каждые две-три минуты, несколько раз переворачивая пробирку. Через 10-20 минут остановите реакцию, добавив от трех до пяти миллилитров ледяной среды для роста. Энергично прокрутите трубку несколько раз.
Отфильтруйте суспензию, содержащую фибробласты, через 85-микронную нейлоновую сетку в 50-миллилитровую пробирку. Центрифугируйте раствор фибробластов в дозе 150 г в течение 10 минут. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в 100-200 микролитрах полной питательной среды для подсчета клеток.
Поместите клетки в колбу для культуры тканей площадью 25 квадратных сантиметров. Затем инкубируйте колбу при температуре 37 градусов Цельсия. Меняйте среду, содержащую неадгезивные клетки, на следующий день и снова каждые три-четыре дня.
Когда фибробласты достигнут слияния от 70 до 80%, промойте их PBS и добавьте раствор трипсина-ЭДТА. После инкубации колбы в течение трех минут при температуре 37 градусов Цельсия остановите реакцию, добавив от трех до пяти миллилитров теплой среды для полного роста. Затем центрифугируйте клеточную суспензию при 200 г в течение пяти минут.
Удаляют надосадочную жидкость с помощью аспирации. Культивируют фибробласты в среде PRP и инкубируют при 37 градусах Цельсия. Минимальная рекомендуемая плотность клеток составляет 4 000 жизнеспособных клеток на квадратный сантиметр.
Специальное медицинское устройство использовалось для производства PRP путем обработки цельной крови 10 разных пациентов. Устройство удалило большинство эритроцитов и лейкоцитов. Средняя концентрация тромбоцитов в PRP была примерно на 50% выше, чем концентрация тромбоцитов в цельной крови.
Аутологичные фибробласты культивировали в среде с 10% FBS или в среде с концентрацией PRP в диапазоне от одного до 50%После семи дней культивирования, без смены среды, культуры, загрунтованные 20% PRP, показали большее количество жизнеспособных фибробластов. PRP оказывал мощное действие в качестве усилителя пролиферации в 7,7 раза по сравнению с FBS. Окрашивание фаллоидином показало, что морфологические изменения, наблюдаемые при активации PRP, были связаны с реорганизацией F-актина, которая является признаком активации фибробластов.
Основной проблемой быстрого размножения клеток является риск геномной модификации. Чтобы оценить это, вы можете выполнить сравнительный анализ геномной гибридизации для оценки геномной стабильности ваших клеток. Основным преимуществом этого метода является замена FBS на PRP, который является более мощной аутологичной биологической добавкой.
Благодаря этому исследователь может быстрее вырастить больше клеток без добавления каких-либо ксеногенных веществ. Мы можем использовать этот метод для других типов клеток, которые нуждаются в расширении ex vivo перед клиническим применением, например, для кератиноцитов или мезенхимальных стволовых клеток.
