الهدف العام لهذا الإجراء هو إنتاج لقاح جليكوكونجيت متجانس من خلال الجمع بين دمج الأحماض الأمينية غير الكنسية والكيمياء النقر. التوسع في الشفرة الوراثية هو أداة قوية لدمج الأحماض الأمينية غير الطبيعية في البروتينات لتعديل خصائصها، لدراسة أو إنشاء وظائف بروتينية جديدة، أو الحصول على البروتين المتقارن. وقد ظهرت طريقة قمع كودون باعتبارها الطريقة الأكثر شعبية لدمج الأحماض الأمينية غير طبيعية في مواقف مختلفة.
هذه المنهجية سوف تكون هنا تطبيقها على إنتاج الناقل البروتين التي تحتوي على حمض أميني غير طبيعي إيواء مجموعة وظيفية bioorthogonal. ويمكن استخدام هذا المقبض التفاعلي بعد ذلك على وجه التحديد وكفاءة الكسب غير المشروع هابتين أوليغوساشاريد الاصطناعية لتوفير لقاح جليكوكونجيت متجانس. propargyl-lysine, PrK, يتم تصنيعها في خطوتين من التجارية بوك-ليسين.
في الخطوة الأولى، يتم تحويل مجموعة أمينية غير محمية من الـ Boc-lysine إلى كلوروفورمات البربارجيل. في خطوة ثانية، مجموعة ألفا أمينو هو إزالة الحماية. لتجميع N (ألفا) Boc-propargyl-lysine، أولاً حل 500 ملليغرام من بوك-ليسين في خليط من خمسة ملليلتر من صوديوم واحد مائي وخمسة ملليلترات من THF في قارورة وتناسب قارورة مع حاجز السيليكون.
تبريد القارورة في حمام الثلج وانتظر حتى يذوب مسحوق. ثم إضافة البرارجيل الكلوروفورمات قطرة الحكمة على مدى فترة دقيقتين إلى ثلاث دقائق تحت التحريك. سخني خليط التفاعل في درجة حرارة الغرفة و استمر في التحريك لمدة 10 ساعات.
تهدئة حلول من الإيثر ديثيل، مائي واحد حمض الهيدروكلوريك المولر، وإثيل خلات. يبرد خليط التفاعل الخام في حمام جليدي. صب الخليط في قمع فصل.
استخراج خليط مع خمسين ملليلتر من الإيثر ديثيل. قد يؤدي الاستخراج إلى تراكم الضغط، وتأكد من تحرير أي تراكم الضغط بشكل متكرر. جمع المرحلة مائي وتجاهل طبقة العضوية.
إضافة بحذر، خمسون ملليلتر من حمض الهيدروكلوريك مولر واحد إلى المرحلة المائية في القمع فصل. ثم، استخراج طبقة مائي مرتين باستخدام ثلاثين ملليلتر من خلات الإيثيل. جمع المرحلة العضوية، والتحقق من وجود مركب الخاص بك من قبل TLC.
في هذه المرحلة، ينبغي أن يكون في المرحلة العضوية. جفف الطبقات العضوية المجمعة فوق كبريتات المغنيسيوم. تصفية قبالة المرحلة الصلبة.
و مركزة الترشيح تحت ضغط مخفض على المبخر الدوار. حل عينة من النفط الخام N (ألفا)Boc-propargyl-lysine في الكلوروفورم deuterated والسيطرة على هويتها بواسطة NMR. لتجميع propargyl-L-lysine، أدخل N (ألفا)Boc-propargyl-lysine في قارورة زر مستديرة مجهزة الحاجز.
إضافة أربعة ملليلترات من ثنائي كلورو الميثان اللامائية في قارورة تحت الأرجون. إضافة قطرة الحكمة، وأربعة ملليلتر من حمض ثلاثي الفلوراستيك تحت التحريك. استبدل الحاجز السيليكوني لغطاء زجاجي لتجنب TFA من إتلاف حاجز السيليكون.
يُحرّك خليط التفاعل لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تحقق من إلغاء الحماية من Boc-PrK بواسطة TLC. تركيز خليط التفاعل تحت ضغط مخفض.
إضافة ديثيل الأثير إلى بقايا الخام. تصفية بروبارجيل-L-ليسين في شكل الصلبة بيضاء على الزجاج fritted. قم بحل aliquot من propargyl-L-lysine في أكسيد الديوتيريوم، ثم قم بتحليل NMR للتحكم في هويته ونقاوته.
ثم يتم حل Propargyl-L-lysine في الماء المقطر في التركيز النهائي من مائة ملليمولار وتخزينها في ناقص 20 درجة في aliquots ملليلتر واحد. للمشاركة في تحويل plasmids في سلالة التعبير، ذوبان مائة ميكرولتر aliquot من المختصة كيميائيا E.Coli BL21 على الجليد خلال خمس دقائق. إضافة ميكرولتر واحد من كل بلازميد أو 50 إلى 100 نانوغرام من كل في الخلايا واحتضانها لمدة 30 دقيقة على الجليد.
احتضان الخلايا المختصة في 42 درجة، خلال 45 ثانية. ثم، وضعها مرة أخرى على الجليد لمدة دقيقتين. إضافة تسعمائة ميكرولتر من LB المتوسطة واحتضان تحت اهتزاز لمدة ساعة واحدة في 37 درجة للسماح التعبير عن المضادات الحيوية.
ثم لوحة البكتيريا المحولة على LB أجار مع المضادات الحيوية. السماح للبكتيريا أن تنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة. للتعبير عن البروتينات المعدلة مع PrK، تلقيح مستعمرة واحدة شارك في تحويلها في خمسة ملليلتر من LB المتوسطة مع المضادات الحيوية.
احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مع اهتزاز. في اليوم التالي، تمييع مع خمسة ملليلتر من الثقافة الأولية في خمسمائة ملليلتر من المتوسطة لصناعة السيارات في الحث التي تحتوي على المضادات الحيوية، 0.02٪ من L-arabinose، وميليمولار واحد من PrK واحتضان في 37 درجة لمدة 24 ساعة تحت اهتزاز. وتشمل السيطرة السلبية من خلال تنفيذ الثقافة دون PrK والسيطرة الإيجابية من خلال أداء ثقافة استنساخ تحتوي على جين البروتين من النوع البرية.
حصاد الخلايا من ثقافة بين عشية وضحاها عن طريق الطرد المركزي في 5، 000 × ز خلال 10 دقيقة. تجاهل المابير وتجميد بيليه في ناقص 20 درجة. لتنقية البروتين عن طريق الجاذبية تدفق مقاعد البدلاء تقارب اللوني، resuspend الكريات الخلية في عشرين ملليلتر من العازلة تحلل.
إضافة DNase I وlysozyme، والسماح للتحلل عن طريق احتضان التعليق في 37 درجة خلال 30 دقيقة. Sonicate الخلايا في الجليد خلال خمس دقائق، ثم إزالة حطام الخلية عن طريق الطرد المركزي في 20، 000 × ز خلال 30 دقيقة. الترشيح لlysate مع 0.45 مرشح ميكرومتر إضافة ني NTA الراتنج إلى التعليق.
مختلطة بلطف في أربع درجات لمدة ساعة واحدة. صب التعليق في عمود البولي بروبلين وجمع كسر غير منضم. غسل الراتنج بعشرة ملليلترات ثم خمسة ملليلتر من الغسيل العازل.
جمع كسور الغسيل. Elute البروتين له الموسومة مع ملليمتر واحد من عازلة elution وتكرار هذه الخطوة أربع مرات وجمع كل الكسور الإضافية. الجمع بين الكسور التي تحتوي على البروتينات الهستيدين النقي الموسومة وsededed في لتر واحد من TEV protease العازلة بين عشية وضحاها باستخدام غشاء غسيل الكلى.
جمع عينة البروتين في أنبوب 50 ملليلتر وإضافة TEV العازلة للحصول على تركيز النهائي من اثنين ملليغرام لكل ملليلتر في حجم النهائي من ملليلتر واحد. إضافة مائة ميكرولتررس من بروتياز TEV. إضافة 50 ميكرولترات من 0.1 داتوليرس.
كاملة مع TEV العازلة تصل إلى خمسة ملليلتر. احتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات، مع اهتزاز بطيء. لإزالة EDTA، اطلب البروتين عند أربع درجات بين عشية وضحاها باستخدام غشاء غسيل الكلى وعزلة الفوسفات مع خمسة إيميدازول ميليمولار.
للقضاء على بروتين TEV والبروتينات غير المهضومة ، احتضان المزيج مع حبات Ni-NTA وخلط بلطف لمدة ساعة واحدة في أربع درجات. صب التعليق في عمود البولي بروبلين. تم تجميع الكسر غير المنضم.
وteev protease والبروتينات غير المهضومة البقاء ملزمة الخرز والبروتين هو مُلَذَّم. غسل العمود مع خمسة ملليلتر من الغسيل العازلة وجمع كسور الغسيل كذلك. Dialyze البروتين هضم ضد لتر واحد من فوق العازلة في أربع درجات بين عشية وضحاها مع غشاء غسيل الكلى لإزالة imidazole وكذلك لتبادل العازلة.
و قياس تركيز البروتين عند 280 نانومتر لمقارنه mPsaA مع 6-سداسي كلورو-الفلورسين-أزيد، أو مستضد الكربوهيدرات ترياق وظيفية، وضع البروتين تحور PrK بتركيز 57.8 ميكرومولور في أنبوب صغير ملليلتر اثنين. إضافة 10 ميكرولترات من خمسة ملليمترات مركب أزيد، ثم إضافة مزيج ما قبل من محلول كبريتات النحاس و THPTA.
إضافة هيدروكلوريد أمينوجوانيدين. إضافة extemporaneously أعدت محلول مائي من أسكوربات الصوديوم. أغلق الأنبوب، واخلطه عن طريق عكسه عدة مرات، واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين.
وقف رد الفعل عن طريق إضافة EDTA. تحقق من اقتران على صفحة SDS. بعد الهجرة، تصور الجل على ضوء الأشعة فوق البنفسجية في 312 نانومتر للمقارن مع الفلوريسين.
أو وصمة عار مع هلام Coomassie الأزرق لتصور المترافق مع مستضد الكربوهيدرات. كما إضافة hapten ينبغي أن تحفز على تغيير الوزن الجزيئي. تنقية جليكونجوجيت عن طريق تطبيقه على عمود هلام الترشيح توازنها مع برنامج تلفزيوني.
جمع الكسور التي تحتوي على glycoconjugates. للتخزين لفترات طويلة، dialyze الجليكوكونجيت ضد الماء المقطر، ثم تجميد الجافة وتخزين الجليكوكونجيت في ناقص 80 درجة. وقد أدخلت PrK في الموقع 32 في استبدال ليسين بالقرب من N-terminus من PsaA.
وقد تم التحقق من فعالية إنتاج mPsaA من قبل صفحة SDS وتحليل البقعة الغربية باستخدام الأجسام المضادة لعلامة الهستيدين المضادة. وجود كامل طول البروتين يشير بقوة إلى الاندماج الناجح لPrK. ومع ذلك، فإن الكثافة أقل من تلك التي لوحظت لـ mPsaA من النوع البري.
وقد تم تنقية mPsaA (K32PrK) على ني NTA الخرز. مع العائد النموذجي من ثمانية ملليغرام، وقد تم تأكيد إدراج بقايا PrK أخيرا من قبل الطيف الشامل. تمت إزالة العلامة Histidine على الانقسام proteolytic باستخدام protease TEV.
بعد mPsa(K32PrK)تم تقييم التفاعل من ألكين باستخدام الفلوريسين azido وظيفية واستخدامها كذلك لتقارن مستضد oligosaccharide الاصطناعية. وقد أجريت التجارب بالمقارنة مع mPsa من النوع البري كتحكم. وأخيرا، تم تنقية الجليكوكونجوت عن طريق الترشيح هلام هويته وأكد قياس الطيف الشامل.
في هذا المشروع، تم إعداد لقاحات جليكوكونجوت متجانسة باستخدام تقنية قمع كودون وقف العنبر لدمج حمض أميني غير طبيعي تحت مواقع محددة. التجانس اللقاح جليكونجوت هو معيار مهم لضمان توصيف كامل الفيزيائية الكيميائية. وبالتالي، تلبية المزيد والمزيد من التوصيات وكالة المخدرات تطالب.
ولا يُستوفى هذا المعيار باستخدام طريقة الاقتران النقي التقليدية. وعلاوة على ذلك، فإن هذا البروتوكول يجعل من الممكن ضبط بنية لقاح جليكوكونغجيت بدقة. مما أدى إلى أداة غير مسبوقة لدراسة العلاقة بين التجانس وهيكل جليكوكونجوت.
