Общая цель этой процедуры заключается в производстве однородной гликоконъюгации вакцины путем объединения неканонических аминокислот включения и нажмите химии. Расширение генетического кода является мощным инструментом для включения неестественных аминокислот в белки, чтобы изменить их характеристики, изучить или создать новые функции белка, или иметь доступ к протеиновым конъюгратам. Метод подавления кодона стал самым популярным методом включения неестественных аминокислот в разных положениях.
Эта методология будет применяться к производству белкового носителя, содержащего неестественную аминокислоту, укрывательство биоортогонал функциональной группы. Эта реактивная ручка может быть использована для конкретного и эффективного прививки синтетического олигосахарида hapten для обеспечения однородной гликоконъюгации вакцины. Пропаргил-лизин, PrK, синтезируется в двух шагах от коммерческого Boc-lysine.
На первом этапе незащищенная аминокислотная группа Бок-лизина преобразуется в пропаргил хлороформат. На втором этапе альфа-аминогруппа де-защищена. Для синтеза N(альфа)Boc-propargyl-lysine, сначала растворить 500 миллиграммов бок-лизина в смеси из пяти миллилитров аквея один моляр NaOH и пять миллилитров THF в колбе и подходят колбу с кремниевой перегородкой.
Охладить колбу в ледяной ванне и ждать, пока порошок будет растворен. Затем добавьте пропаргил хлороформат дроп-мудрый в течение двух-трех минут под перемешиванием. Разогреть реакционной смеси при комнатной температуре и продолжить перемешивание в течение 10 часов.
Охладить растворы диэтил эфира, aqueous один молярной соляной кислоты, и этил ацетат. Охладить сырую реакционной смесь в ледяной ванне. Налейте смесь в разделительную воронку.
Извлекайте смесь с пятьдесятю миллилитров дителилового эфира. Извлечение может привести к наращиванию давления, убедитесь, что вы отпустите любое давление накопления часто. Соберите aqueous фазы и отказаться от органического слоя.
Добавьте осторожно, пятьдесят миллилитров одной молярной соляной кислоты в aqueous фазы в разделительной воронке. Затем извлечения аквея слой в два раза с помощью тридцати миллилитров этилового ацетата. Соберите органическую фазу, убедитесь в наличии вашего соединения TLC.
На данном этапе он должен быть в органической фазе. Высушите комбинированные органические слои над сульфатом магния. Отфильтруй твердую фазу.
И сконцентрировать фильтрат под пониженным давлением на роторный испаритель. Растворите образец сырой жирной N(альфа)Бок-пропаргил-лизин в дейтетерированном хлороформе и контролировать его идентичность СМР. Чтобы синтезировать пропаргиль-L-лизин, ввемите N(альфа)Бок-пропаргыл-лизин в круглую кноповицу, оснащенную перегородкой.
Добавьте четыре миллилитров ангидроус-дихлорметана в колбу под аргоном. Добавить капли мудрый, четыре миллилитров трифтороацевой кислоты под перемешивание. Замените кремниевую перегородку на стеклянную крышку, чтобы избежать повреждения кремниевой перегородки TFA.
Перемешать реакционной смеси в течение одного часа при комнатной температуре. Проверить де-защиту Бок-ПрК TLC. Сосредоточьте реакционной смеси под пониженным давлением.
Добавить дитетил эфира в сырой остаток. Фильтр пропаргил-L-лизин в виде белого твердого тела на fritted-стекло. Растворите алицит пропаргила-L-лизина в оксиде дейтерия, а затем провести анализ ЯМР, чтобы контролировать его идентичность и чистоту.
Пропаргил-Л-лизин затем растворяется в дистиллированной воде при конечной концентрации в сто миллимолярной и хранится при температуре минус 20 градусов в одном миллилитр aliquots. Чтобы совместно преобразовать плазмиды в экспрессивный штамм, разморозите сто микролитров алицит химически компетентных E.Coli BL21 на льду в течение пяти минут. Добавьте один микролитер каждой плазмиды или от пятидесяти до ста нанограммов каждого в клетки и инкубировать их в течение 30 минут на льду.
Инкубировать компетентные клетки при 42 градусах, в течение 45 секунд. Затем, положить их обратно на лед в течение двух минут. Добавить девятьсот микролитров LB среднего и инкубировать под встряхивания в течение одного часа при 37 градусах, чтобы антибиотики выражение.
Затем пластины преобразованных бактерий на LB агар с антибиотиками. Позвольте бактериям расти в одночасье при 37 градусах. Чтобы выразить белки, модифицированные с PrK, привить одну ко-преобразованную колонию в пяти миллилитров LB среды с антибиотиками.
Инкубировать на ночь при 37 градусах при тряске. На следующий день разбавляют пятью миллилитров первичной культуры в пятистах миллилитров автоиндукционной среды, содержащей антибиотики, 0,02% L-арабинозы и один миллимолер PrK и инкубируют при 37 градусах в течение 24 часов под тряской. Включите отрицательный контроль, выполняя культуру без PrK и положительный контроль, выполняя культуру клона, содержащего ген белка дикого типа.
Урожай клеток из ночной культуры центрифугации на 5000 х г в течение 10 минут. Откажитесь от супернатанта и заморозьте гранулы при минус 20 градусах. Для очищения белка гравитационным потоком-скамейкой сродства хроматографии, повторно посовестите клеточные гранулы в двадцать миллилитров буфера лиза.
Добавить DNase I и lysozyme, и позволяют лиза путем инкубации подвески при 37 градусах в течение 30 минут. Sonicate клетки во льду в течение пяти минут, а затем удалить клеточный мусор центрифугации на 20000 х г в течение 30 минут. Фильтр лизат с 0,45 микрометрового фильтра Добавить Ni-NTA смолы к подвеске.
Смешанные осторожно при четырех градусах в течение одного часа. Налейте суспензию в полипропиленовую колонку и соберите несысяную фракцию. Вымойте смолу десятью миллилитров, а затем пять миллилитров стирального буфера.
Соберите фракции для мытья. Elute Его помеченный белок с одним миллиметром буфера элюции и повторить этот шаг четыре раза и собрать все дополнительные фракции. Объедините фракции, содержащие чистые белки с гистидином, и облизвайте их в один литр буфера протеазы TEV на ночь с помощью диализной мембраны.
Соберите образец белка в 50 миллилитровую трубку и добавьте буфер TEV, чтобы получить окончательную концентрацию в два миллиграмма на миллилитр в окончательном объеме одного миллилитра. Добавьте сто микролитров протеазы TEV. Добавьте 50 микролитров 0,1 молярного DTT.
В комплекте с буфером TEV до пяти миллилитров. Инкубировать на ночь при четырех градусах, с медленной тряской. Чтобы удалить ЭДТА, диализ белка на четыре градуса в одночасье с помощью диализа мембраны и фосфатного буфера с пятью миллимоляном имидазолом.
Чтобы исключить TEV protease и непереваренные белки, инкубировать смесь с бисером Ni-NTA и аккуратно перемешать в течение одного часа при четырех градусах. Налейте подвеску в полипропиленовую колонку. Собрана несысяная фракция.
Протеаза TEV и непереваренные белки остаются связанными с бисером, а переваренный белок элайтирован. Вымойте колонку с пятью миллилитров стирального буфера и собирать мыть фракций, а также. Dialyze переваренный белок против одного литра буфера щелчка на 4 градусах всю ночь с мембраной диализа для того чтобы извлечь imidazole также, как обменять буфер.
И измерить концентрацию белка на 280 нанометров. Чтобы спрягать MPsaA с 6-hexachloro-флуоресцеин-азид, или противоядие-функционализированный углеводный антиген, положить PrK мутировал белок в концентрации 57,8 микромолара в две миллилитровые микро трубки. Добавьте 10 микролитров из пяти миллимолярной азидной смеси, затем добавьте предварительное сочетание раствора сульфата меди и THPTA.
Добавьте гидрохлорид аминогуанидина. Добавить extemporaneously подготовленный aqueous раствор аскорбат натрия. Закройте трубку, перемешайте несколько раз и инкубировать при комнатной температуре в течение двух часов.
Остановите реакцию, добавив EDTA. Проверьте спряжение на странице SDS. После миграции визуализуйте гель на ультрафиолетовом свете на 312 нанометров для спряжения с флуорессейном.
Или пятно гель с Coomassie Blue, чтобы визуализировать конъюг с углеводным антигеном. По мере того как добавление hapten должно навести изменение молекулярного веса. Очистите гликоконсугации, применяя его к гель-фильтрации колонки equilibrated с PBS.
Соберите фракции, содержащие гликоконъюгации. Для длительного хранения, диализ гликоконъюгировать против дистиллированной воды, затем заморозить сухой и хранить гликоконъюг при температуре минус 80 градусов. PrK был введен на позиции 32 в замене лизина вблизи N-терминуса PsaA.
Эффективность производства MPsaA была проверена на странице SDS и западный анализ помарки с использованием антител анти-гистидина тега. Наличие белка полной длины сильно указывает на успешное включение PrK. Интенсивность, однако, ниже, чем наблюдается для диких типа MPsaA.
Депутаты (K32PrK) были очищены от бисера Ni-NTA. При типичной урожайности в восемь миллиграммов и включение остатков PrK, наконец, было подтверждено масс-спектрометрии. Тег гистидина был удален на протеолитическое расщепление с помощью протеазы TEV.
Имея MPsaA (K32PrK)реактивность алкин был оценен с помощью азидо-функционализированных флуорескеин и далее используется для конъюгации синтетического антигена олигосахарида. Эксперименты проводились по сравнению с депутатами дикого типа в качестве контроля. Наконец, гликоконъюг был очищен фильтрацией геля и его идентичностью, подтвержденной масс-спектрометрией.
В рамках этого проекта, однородные гликоконъюгированные вакцины были подготовлены с использованием технологии подавления остановки янтаря кодона для включения неестественной аминокислоты в определенных местах. Однородность гликоконъюгации вакцины является важным критерием для обеспечения полной физико-химической характеристики. И тем самым, удовлетворяя все более и более требовательные рекомендации наркологов.
Этот критерий не удовлетворяется с помощью классического метода чистой спряжения. Кроме того, этот протокол позволяет тонко настроить структуру гликоконъюгации вакцины. Это беспрецедентный инструмент для изучения взаимосвязи между однородностью и структурой гликоконъюгата.
