L'obiettivo generale di questa procedura è quello di produrre un vaccino glicoconi coniugato omogeneo combinando l'incorporazione di amminoacidi non canonici e la click-chemistry. L'espansione del codice genetico è un potente strumento per incorporare amminoacidi innaturali nelle proteine per modificarne le caratteristiche, studiare o creare nuove funzioni proteiche o avere accesso ai coniugati proteici. Un metodo di soppressione del codone è emerso come il metodo più popolare per incorporare amminoacidi innaturali in diverse posizioni.
Questa metodologia sarà qui applicata alla produzione di un portatore proteico contenente un amminoacido innaturale che ospita un gruppo funzionale bioorthogonale. Questo manico reattivo può essere successivamente utilizzato per innestare in modo specifico ed efficiente un oligosaccaride sintetico hapten per fornire un vaccino omogeneo glicoconi coniugato. La propargil-llysina, PrK, è sintetizzata in due fasi dalla Boc-llysina commerciale.
Nel primo passo, l'amminogruppo non protetto della Boc-lisina viene convertito in propargyl cloroformato. In un secondo passaggio, l'amminogruppo alfa è de-protetto. Per sintetizzare la N(alfa)Boc-propargil-lisina, sciogliere prima 500 milligrammi di Boc-lisina nella miscela di cinque millilitri di acquoso naoh molare e cinque millilitri di THF in un pallone e montare il pallone con un setto di silicio.
Raffreddare il pallone in un bagno di ghiaccio e attendere che la polvere venga sciolta. Quindi aggiungere il propargyl cloroformato drop-wise per un periodo di due o tre minuti sotto agitazione. Riscaldare la miscela di reazione a temperatura ambiente e continuare l'agitazione per 10 ore.
Raffreddare le soluzioni di etere dietile, acquoso acido cloridrico molare e acetato di etile. Raffreddare la miscela di reazione grezza in un bagno di ghiaccio. Versare il composto in un imbuto di separazione.
Estrarre una miscela con cinquanta millilitri di etere dietile. L'estrazione può comportare un accumulo di pressione, assicurarsi di rilasciare frequentemente qualsiasi accumulo di pressione. Raccogliere la fase acquosa e scartare lo strato organico.
Aggiungere con cautela, cinquanta millilitri di un acido cloridrico molare alla fase acquosa nell'imbuto di separazione. Quindi, estrarre lo strato acquoso due volte usando trenta millilitri di acetato di etile. Raccogli la fase organica, verifica la presenza del tuo composto da TLC.
In questa fase, dovrebbe essere in fase organica. Asciugare gli strati organici combinati sul solfato di magnesio. Filtrare la fase solida.
E concentrare il filtrato sotto pressione ridotta su un evaporatore rotante. Sciogliere il campione del petrolio grezzo N(alfa)Boc-propargil-lisina in cloroformio deuterato e controllarne l'identità mediante NMR. Per sintetizzare la propargil-L-lisina, introdurre la N(alfa)Boc-propargil-lisina in un pallone a bottone rotondo dotato di setto.
Aggiungere quattro millilitri di diclorometano anidro nel pallone sotto argon. Aggiungere, per quanto riguarda la goccia, quattro millilitri di acido trifluoroacetico sotto agitazione. Sostituire il setto di silicio per un coperchio di vetro per evitare che il TFA danneggi il setto di silicio.
Mescolare la miscela di reazione per un'ora a temperatura ambiente. Verificare la deprotezione del Boc-PrK da parte di TLC. Concentrare la miscela di reazione sotto pressione ridotta.
Aggiungere l'etere dietile al residuo grezzo. Filtrare la propargil-L-lisina sotto forma di un solido bianco su un bicchiere fritte. Sciogliere un'aliquota della propargil-L-lisina nell'ossido di deuterio, quindi effettuare analisi NMR per controllarne l'identità e la purezza.
La propargil-L-lisina viene quindi sciolta in acqua distillata alla concentrazione finale di cento millimolare e conservata a meno 20 gradi in aliquote millilitre. Per co-trasformare i plasmidi nel ceppo di espressione, scongelare un'aliquota di cento microlitri di E.Coli BL21 chimicamente competente sul ghiaccio per cinque minuti. Aggiungere un microlitro di ogni plasmide o da cinquanta a cento nanogrammi di ciascuno nelle cellule e incubarli per 30 minuti sul ghiaccio.
Incubare le cellule competenti a 42 gradi, per 45 secondi. Quindi, rimetteteli in ghiaccio per due minuti. Aggiungere novecento microlitri di mezzo LB e incubare sotto scuotimento per un'ora a 37 gradi per consentire l'espressione degli antibiotici.
Quindi placcare i batteri trasformati sull'agar LB con antibiotici. Consentire ai batteri di crescere durante la notte a 37 gradi. Per esprimere proteine modificate con PrK, inoculare una singola colonia co-trasformata in cinque millilitri di mezzo LB con antibiotici.
Incubare durante la notte a 37 gradi con tremori. Il giorno dopo, diluire con i cinque millilitri della coltura primaria in cinquecento millilitri di mezzo auto-induzione contenente antibiotici, 0,02% di L-arabinosi e un millimolare di PrK e incubare a 37 gradi per 24 ore sotto scuotimento. Includere un controllo negativo eseguendo la coltura senza PrK e il controllo positivo eseguendo la coltura di un clone contenente il gene proteico di tipo selvatico.
Raccogliere le cellule dalla coltura notturna per centrifugazione a 5.000 x g per 10 minuti. Scartare il supernatante e congelare il pellet a meno 20 gradi. Per la purificazione della proteina mediante cromatografia di affinità del banco di flusso gravitazionale, rimescolare il pellet cellulare in venti millilitri di tampone di lysis.
Aggiungere la DNasi I e il lisozima e consentire la lisi incubando la sospensione a 37 gradi per 30 minuti. Sonicare le cellule nel ghiaccio per cinque minuti, quindi rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione a 20.000 x g per 30 minuti. Filtrate il lysate con filtro da 0,45 micrometri Aggiungere la resina Ni-NTA alla sospensione.
Mescolato delicatamente a quattro gradi per un'ora. Versare la sospensione in una colonna di polipropilene e raccogliere la frazione non vincolata. Lavare la resina con dieci millilitri e poi cinque millilitri di tampone di lavaggio.
Raccogliere le frazioni di lavaggio. Elute la proteina His-tagged con un millimetro di tampone di eluizione e ripetere questo passaggio quattro volte e raccogliere tutte le frazioni aggiuntive. Unire le frazioni contenenti proteine pure taggate all'istidina e dializzarle in un litro di tampone di proteasi TEV durante la notte utilizzando la membrana di dialisi.
Raccogliere il campione proteico in un tubo da 50 millilitri e aggiungere il tampone TEV per ottenere una concentrazione finale di due milligrammi per millilitro in un volume finale di un millilitro. Aggiungere cento microlitri di proteasi TEV. Aggiungere 50 microlitri di DTT molare 0,1.
Completo di tampone TEV fino a cinque millilitri. Incubare durante la notte a quattro gradi, con scuotimenti lenti. Per rimuovere l'EDTA, dializzare la proteina a quattro gradi durante la notte utilizzando membrana dialisi e tampone fosfato con cinque imidazolo millimolare.
Per eliminare la proteasi TEV e le proteine non digerite, incubare il mix con perline Ni-NTA e mescolare delicatamente per un'ora a quattro gradi. Versare la sospensione in una colonna di polipropilene. Raccolta della frazione non vincolata.
La proteasi TEV e le proteine non digerite rimangono legate alle perline e la proteina digerita viene eluita. Lavare la colonna con cinque millilitri di tampone di lavaggio e raccogliere anche le frazioni di lavaggio. Dializzare la proteina digerita contro un litro di tampone click a quattro gradi durante la notte con membrana di dialisi per rimuovere l'imidazolo e scambiare il tampone.
E misurare la concentrazione della proteina a 280 nanometri. Per coniugare la mPsaA con 6-esacloro-fluoresceina-azide, o un antigene di carboidrati funzionalizzato all'antidoto, mettere la proteina mutata PrK ad una concentrazione di 57,8 micromolare in un microtubo da due millilitri. Aggiungere 10 microlitri di cinque composti millimolare di azide, quindi aggiungere un pre-mix di soluzione di solfato di rame e THPTA.
Aggiungere il cloridrato di aminoguanidina. Aggiungere la soluzione acquosa estemporaneamente preparata di ascorbato di sodio. Chiudere il tubo, mescolare invertendo più volte e incubare a temperatura ambiente per due ore.
Interrompere la reazione aggiungendo EDTA. Controlla la coniugazione nella pagina SDS. Dopo la migrazione, visualizzare il gel sulla luce UV a 312 nanometri per il coniugato con fluoresceina.
Oppure macchiare il gel con Coomassie Blue per visualizzare il coniugato con l'antigene dei carboidrati. Come aggiunta degli hapten dovrebbe indurre un cambiamento di peso molecolare. Purificare il glicoconi coniugato applicandolo a una colonna di filtrazione gel equilibrata con PBS.
Raccogliere le frazioni contenenti i glicoconi coniugati. Per una conservazione prolungata, dializzare il glicoconi coniugato contro l'acqua distillata, quindi congelare e conservare il glicoconi coniugato a meno 80 gradi. Il PrK è stato introdotto nella posizione 32 in sostituzione di una lsina vicino al capolinea N del PsaA.
L'efficacia della produzione di mPsaA è stata controllata dalla pagina SDS e dall'analisi western blot utilizzando anticorpi anti-istidina tag. La presenza di una proteina a figura intera indica fortemente il successo dell'incorporazione del PrK. L'intensità è tuttavia inferiore a quella osservata per i parlamentari di tipo selvaggio.
Il mPsaA(K32PrK) è stato purificato sulle perline Ni-NTA. Con una resa tipica di otto milligrammi e l'incorporazione del residuo prk è stata infine confermata dalla spettrometria di massa. L'etichetta istidina è stata rimossa dopo la scissione proteolitica usando la proteasi TEV.
Avendo la mPsaA(K32PrK) la reattività dell'alchine è stata valutata utilizzando una fluoresceina funzionalizzata all'azido e ulteriormente utilizzata per coniugare un antigene oligosaccaride sintetico. Gli esperimenti sono stati fatti rispetto al mPsaA di tipo selvaggio come controllo. Infine, il glicoconi coniugato è stato purificato dalla filtrazione del gel e la sua identità confermata dalla spettrometria di massa.
In questo progetto, sono stati preparati vaccini omogenei per il glicoconi coniugato utilizzando la tecnologia di soppressione del codone di arresto ambrato per incorporare un amminoacido innaturale in siti definiti. L'omogeneità del vaccino glicoconi coniugato è un criterio importante per garantire una caratterizzazione fisico-chimica completa. E così, soddisfacendo sempre più esigenti le raccomandazioni dell'agenzia del farmaco.
Questo criterio non è soddisfatto utilizzando il classico metodo di coniugazione pura. Inoltre, questo protocollo consente di ottimizzare finemente la struttura del vaccino glicoconi coniugato. Dando origine a uno strumento senza precedenti per studiare la relazione tra l'omogeneità e la struttura di un glicoconi coniugato.
