إن مقايسة الغلاف العصبي مفيدة في تقنية المختبر لدراسة الخصائص المتأصلة للخلايا الجذعية العصبية/الخلايا السلف بما في ذلك الانتشار والتجديد الذاتي وتعدد القدرات في السياق الفسيولوجي والمرضي على حد سواء. نظرا لبنيتها ثلاثية الأبعاد، هذه التقنية هي أدوات قوية لدراسة تولد الأعصاب الكبار. كما أنه مفيد لاستزراع والحصول على غلة أعلى من الخلايا الجذعية العصبية / السلف.
يمكن تطبيق هذا الفحص العصبي على دراسة اضطرابات الدماغ مثل مرض الزهايمر وأمراض باركنسون أو التصلب المتعدد. يمكن الحصول على الخلايا العصبية أيضا من مناطق أو أنظمة أخرى في الدماغ، مثل الأنسجة الدهنية أو الأمعاء. التظاهر الإجراء مع فيليبا ريبيرو ستكون ريتا سواريس، طالبة دكتوراه في مجموعتي.
لحصاد اليوم التالي للولادة من 1 إلى 3 أدمغة فأرة، أمسك الجزء البطني من الجسم عند قاعدة الرأس واستخدم مقصًا مدببًا صغيرًا لإجراء شق في الجلد على طول الرأس لفضح الجمجمة. جعل شق طولي في قاعدة الجمجمة ومواصلة قطع على طول خياطة القوس في زاوية ضحل ممكن لتجنب إتلاف هياكل الدماغ. استخدم ملقط منحنية لقشر الجمجمة إلى الجانبين لفضح الدماغ وشريحة ملعقة صغيرة تحت الدماغ لقطع الأعصاب القحفية والأوعية الدموية التي ترتبط بقاعدة الدماغ.
وضع الدماغ في طبق بيتري من HBSS الباردة تكملها المضادات الحيوية ووضع الطبق تحت مجهر تشريح في التكبير منخفضة. ضع الدماغ على سطحه الظهري. أثناء الإمساك بالدماغ عن طريق المخيخ، استخدم ملقطًا ناعمًا لإزالة السحايا من الجانب البطني من الدماغ والمصابيح الشمية.
تدوير الدماغ على الجانب البطني وتقشر قبالة بقية السحانيات. ثم استخدم ملقط لإزالة المخيخ واستخدام ملقط مدببة منحنية لنقل الدماغ على قطعة من ورقة التصفية مع مسام 11 ميكرومتر على رأس المروحية الأنسجة. لSVZ وDG microdissection، تبدأ بتقطيع الدماغ إلى 450 ميكرومتر أقسام التاجية.
استخدام lamina الرطب لجمع الدماغ مقطعة في طبق بيتري جديد مليئة المضادات الحيوية الباردة تكمل HBSS تحت مجهر تشريح واستخدام ملقط لفصل شرائح الإكليل بطريقة من الأمامي إلى الخلفي حتى يتم التوصل إلى شرائح مع البطينين الجانبي. استخدام ملقط غرامة لقطع طبقة رقيقة من الأنسجة المحيطة الجدار الجانبي للبطينين، باستثناء parenchyma سترياتال والكالوسوم الجسم ووضع طرف واحد من ملقط مباشرة تحت الكولوسوم الجسم والآخر في الأنسجة المجاورة مباشرة للمنطقة البطينية من البطين الجانبي لعزل SVZ. قطع خط صغير من الأنسجة المحيطة البطين الجانبي وجمع الأنسجة تشريح في أنبوب عينة تحتوي على مكملات HBSS الحل.
عندما تم الوصول إلى جميع الشرائح microdissected مع ملقط وتشكيل فرس النهر، والتخلص من الشريحة الأولى مع قرن آمون الذي DG لا يزال لا يمكن التعرف عليها. لإزالة DG، أولا عزل قرن آمون من شرائح وإعادة تركيز المجهر لتصور الحدود حول DG. لحصاد DG، استخدم ملقط لجعل قطع بين DG ومنطقة CA1 تليها قطع عمودي بين DG ومنطقة CA3. ثم إزالة الفمبرية وأي الأنسجة المجاورة ووضع الأنسجة المحصودة في أنبوب منفصل من محلول HBSS مكملة للمضادات الحيوية.
للفك العينات SVZ وDG، إضافة تريبسين-EDTA 0.05٪ إلى تركيز نهائي من 5-10٪ من تريبسين-EDTA 0.05٪ في HBSS إلى كل أنبوب لاحتضان ما يقرب من 50 دقيقة في 37 درجة مئوية. الاستخدام الكامل لل تريبسين أو فترة حضانة طويلة جدا يمكن أن يؤدي إلى زيادة موت الخلايا, تؤثر سلبا على نمو الخلايا. عندما تتجمع الأنسجة معا، استبدال محلول انزيم لأربعة يغسل متتالية مع ملليلتر واحد من ابر هبس الطازجة المكملة لكل غسل.
بعد الغسيل الأخير، resuspend الأنسجة المهضوبة في ملليلتر واحد من المتوسطة خالية من المصل تستكمل مع 10 نانوغرام لكل ملليلتر من عامل النمو البشرة وخمسة نانوغرام لكل ملليلتر من عامل النمو الليفي الأساسي لكل أنبوب. ثم تفكيك ميكانيكيا الأنسجة مع الأنابيب لطيف سبع إلى 10 مرات مع أنبوب P1000 حتى تم الحصول على حل الخلية المتجانسة. لتحديد كثافة DG أو الخلية SVG المنفصلة، عد الخلايا في كل تعليق على مقياس دموي.
لتوسيع الخلايا إلى neurospheres، تمييع مجموعات الخلايا الفردية في مرتين عشر إلى الخلايا الرابعة في كثافة المليلتر في المتوسطة خالية من المصل تكملها عوامل النمو وبذور خمسة ملليلتر من تعليق الخلية في أطباق بيتري غير المصقولة قطر 60 ملليمتر. ثم احتضان خلايا SVZ لمدة ستة إلى ثمانية أيام وخلايا DG لمدة 10 إلى 12 يوما في 37 درجة مئوية لتشكيل الغلاف العصبي الأولية. عندما يكون معظم neurospheres 150 إلى 200 ميكرومتر القطر، حصاد تعليق الخلية من الثقافات وجمع الخلايا العصبية عن طريق الطرد المركزي.
Resuspend منصة الغلاف العصبي مع طقم تجزئة الماوس الكيميائية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة قبل جمع الخلايا مع طرد مركز آخر. استبدال سوبرنات مع ملليلتر واحد من المتوسطة خالية من المصل تكملها عوامل النمو ومحاولة بلطف لتقييم بيليه حوالي 10 مرات. عد الخلايا العصبية المنفصلة كما أظهرت وإعادة من الخلايا في مرتين 10 إلى الخلايا الرابعة في كثافة المليلتر في المتوسطة خالية من المصل تكملها عوامل النمو في أطباق بيتري 60 ملليلتر جديدة.
ثم ارجع الخلية إلى حاضنة ثقافة الخلية لمدة ستة إلى ثمانية أيام إضافية أو 10 إلى 12 يوماً حسب الاقتضاء للحصول على neuro ثانوي. تتكون الخلايا العصبية SVG و DG التي يتم الحصول عليها باستخدام مقايسة الغلاف العصبي من خلايا إيجابية إيجابية من Sox2 غير متمايزة. وتجدر الإشارة إلى أن المغنطيس العصبي المشتق من SVG له أبعاد أكبر من نظيرها DG.
الأهم من ذلك، في ظل ظروف التمايز، SVG وDG المستمدة الخلايا الجذعية /السلف العصبية تهاجر من الخلايا العصبية، وتشكيل pseudomonolayer من الخلايا. في كل من المناطق العصبية، فمن الممكن أن نلاحظ وجود Sox2 إيجابية مزدوجة، nestin إيجابية مزدوجة، مزدوجcortin أزواج الخلايا السلبية المزدوجة المقابلة لتقسيمات متناظرة تدل على التجديد الذاتي. أزواج الخلايا التي خلية واحدة من Sox2 إيجابية، nestin إيجابية، و doublecortin السلبية، والخلية الأخرى Sox2 السلبية، نستين سلبية، ومزدوجةcortin إيجابية مما يدل على الانقسامات غير المتماثلة.
وSx2 السلبية المزدوجة، nestin السلبية المزدوجة، ومزدوجة paircortin مزدوج أزواج الخلايا الإيجابية المقابلة لتقسيمات متناظرة تدل على التمايز. عموما، تمرير يغير معدل وفيات الخلايا في اليوم الثاني في المختبر. يمكن تقييم تولد نيوريتوجين في الخلايا العصبية التي تم الحصول عليها من تمايز خلايا الجذعية العصبية SVG وDG/السلف في بداية التمايز.
كما لوحظ، وطول وتشعب neurites يزيد مع التمايز. ويلاحظ أن نسبة عالية من الخلايا التكاثرية في SVG مقارنة DG. على الرغم من أن النسبة المئوية لتكاثر السلف التي تفرق في الخلايا العصبية ناضجة مماثلة في كل من المنافذ العصبية. كلا النوعين من الخلايا هي أيضا قادرة على التفريق في الخلايا العصبية غير ناضجة, النيوترونات ناضجة, oligodendrocytes الخلايا السلائف, oligodendrocytes ناضجة, والخلايا الفلكية.
بعد الحصول على الخلايا العصبية، يمكن تنفيذ عدة طرق بما في ذلك الكيمياء المناعية، وتصوير الكالسيوم، والبقع الغربية وRT-PCR لدراسة الجذعية وتعدد القدرات للخلايا الجذعية العصبية / السلف. يمكن تطبيق مقايسة الغلاف العصبي على النماذج الوراثية والمرضية لمواصلة تقييم العمليات الجزيئية والخلوية التي تنطوي على انتشار وتمايز الخلايا الجذعية العصبية / السلف.
