الهدف العام من هذا البروتوكول الضرر Drosophila هو مراقبة كل من الحفاظ على التشكل المحوري والتشابكي ، وكذلك وظيفة متشابك من محاور عصبية واشتباكاتها. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه المقايسات لتوصيف عوامل الصيانة العصبية, دراسة النقل المحوري, أو تحليل organelles محور عصبي في محاور سليمة. يسمح فحص إصابة الجناح الجزئي بمراقبة المحاور المصابة التي تخضع للانحطاط جنبًا إلى جنب مع محاور التحكم غير المصابة داخل حزمة الأعصاب نفسها في جناح دروسوفيليا.
يمكن بسهولة أن تمارس هذه الذبذبات إصابة مسبقا في الذباب من النوع البرية عن طريق تطبيق قطع تقريبا في منتصف الجناح مع مقص صغير. تسمح الإصابة الداخلية بتقييم مورفولوجيا المحور المحوري واستخدام علم النظر البصري لتصور الحفاظ الوظيفي على محور عصبي وتشابكها العصبي. يتطلب استئصال الهوائي وجود أيدي ثابتة.
ويوصى أيضاً بممارسة إزالة الهوائيات في الذباب البري من النوع مسبقاً. في الإدمان ، أي optogenetics الإعداد المتاحة هو مناسبة لتنشيط الخلايا العصبية في ذبابة مع قبعة. خلاف ذلك ، يمكن بسهولة إعداد بسيطة يمكن بناؤها من الصفر.
للبدء، استخدم خمس إناث عذراء وخمسة ذكور من النوع الجيني الأيمن لأداء الصلبان في درجة حرارة الغرفة. نقل الجيل P0 إلى قارورة جديدة كل ثلاثة إلى أربعة أيام. جمع حديثا eclosed الكبار ذرية F1 جيل يوميا في قوارير جديدة وعمرها لمدة سبعة إلى 14 يوما.
بعد التخدير، واستخدام مقص صغير لقطع الوريد الجناح الداخلي تقريبا في منتصف الجناح. استخدام جناح واحد للإصابة والجناح الآخر كسن مطابقة السيطرة غير المصابة. تطبيق إصابة واحدة لكل جناح وتأكد من الحصول على 15 جناحا بجروح.
استعادة الذباب في الأغذية التي تحتوي على قوارير. بعد ذلك ، مع ماصة ، تنتشر 10 ميكرولترات من زيت الهالوكربون 27 على طول شريحة زجاجية كاملة. يوم أو سبعة أيام بعد الإصابة، واستخدام مقص صغير لقطع المصابين، فضلا عن الجناح السيطرة غير المصابين.
استخدام ملاقط للاستيلاء على الجناح في المركز، جبل أقصى أربعة أجنحة في زيت الهالوكربون 27 وتغطية لهم مع شريحة الغطاء. صور من GFP المسمى الخلايا العصبية في الجناح يمكن الحصول عليها بسهولة مع قرص الغزل. ومع ذلك، فإن وقت الاستحواذ يجب أن يتم تنفيذه في غضون أقل من ثماني دقائق بعد تركيب الأجنحة لأن الطبق غير ثابت.
صورة الجناح على الفور باستخدام مجهر القرص الغزل. الحصول على سلسلة من المقاطع البصرية على طول المحور Z مع حجم الخطوة ميكرومتر 0.33 وضغط Z- مكدسات في ملف واحد للتحليلات اللاحقة. عبر خمس الإناث العذراء وخمسة ذكور من النمط الجيني الأيمن وجمع جيل F1 كما كان سابقا.
بعد التخدير، استخدم ملاقط لتمل الجزء الأيمن من الهوائي الثالث للاستئصال من جانب واحد أو كل من شرائح الهوائيات الثالثة اليسرى واليمنية للاستئصال الثنائي. هذا يزيل GFP تسمية الهيئات الخلايا العصبية بينما تبقى الإسقاطات محور عصبي في الجهاز العصبي المركزي. اعتمادا على الخلايا العصبية التي تحمل اسم GFP المستخدمة في هذه التقنية، من المهم معرفة ما إذا كانت الهيئات الخلية تقع في الجزء الثالث أو في الجزء الثاني من الهوائي لمحسب الإصابة اللاحقة.
استعادة الذباب في الأغذية التي تحتوي على قوارير. بعد التخدير، واستخدام ملاقط للاستيلاء على الرقبة وملاقط أخرى لإصلاح الصدر. سحب بلطف الرقبة ورأس قبالة الصدر.
باستخدام ملاقط التي تم غمسها في حل تحديد, نقل جميع رؤساء في أنبوب 1.5 ملليلتر microcentuge التي تحتوي على ملليلتر واحد من حل إصلاح 4٪ paraformaldehyde و 0.1 تريتون X100 في برنامج تلفزيوني. إصلاح رؤساء لمدة 20 دقيقة مع التحريض لطيف في درجة حرارة الغرفة. ثم وضع أنبوب microcentrifuge على الجليد ورؤوس تنجذب إلى الجزء السفلي من أنبوب microcentrifuge.
إزالة supernatant مع ماصة وإضافة ملليلتر واحد من العازلة الغسيل التي تحتوي على 0.1٪ triton X100 في برنامج تلفزيوني. ضع الأنبوب على عجلة تحول في درجة حرارة الغرفة ليغسل لمدة دقيقتين. كرر الغسيل أربع مرات إضافية لإزالة حل التثبيت المتبقي.
بعد إعداد العقول، والحصول على شريحة الغلاف، عصا شريط مختبر على ذلك، وقطع شكل T مثل من الشريط. استخدام 20 إلى 200 طرف ماصة ميكرولتر حيث تم قطع ثلاثة ملليمترات من طرف لتوسيع فتح ماصة. الماصات الدماغ التي تحتوي على كاشف antifade على الشريحة وتغطية العقول مع شريحة الغطاء.
استخدام الطين لإعداد اثنين من لفات حتى صغيرة. تأكد من أن لفات الطين ليست أعلى من ارتفاع الشريحة الزجاجية. عصا لفات الطين على الشريحة الزجاجية ووضع الدماغ التي تحتوي على غطاء ساندويتش الشريحة على لفات الطين.
المضي قدما وفقا للمخطوطة. لإعداد الذباب ل optogenetics ، تذوب أولا يطير الغذاء في الميكروويف. بعد أن يبرد الطعام ، قبل التصلب ، أضف 20 ملليمولار جميع عبر شبكية العين في الإيثانول إلى تركيز نهائي من 200 ميكرومولار.
تخلط جيدا وتصب الطعام فورا في قارورة فارغة. تغطية قوارير تحتوي على المواد الغذائية الصلبة مع المقابس أو كرات القطن. التفاف قوارير مع رقائق الألومنيوم.
ثم، تخزين المواد الغذائية التي تحتوي على قوارير في غرفة باردة داكنة. استخدام خمس الإناث العذراء وخمسة ذكور من النمط الجيني الأيمن لأداء الصلبان في درجة حرارة الغرفة وجمع جيل F1 كما كان سابقا في قوارير مغطاة الألومنيوم التي تحتوي على 200 ميكرومولار جميع عبر شبكية العين في الغذاء يطير. بعد ذلك ، جمع الذباب عن طريق التنصت عليها من المواد الغذائية التي تحتوي على قنينات في قارورة فارغة مع عدم وجود طعام.
تبريد القارورة في الجليد التي تحتوي على الماء لمدة 30 ثانية تقريبا. الذباب يغفو الآن ، وضعت بسرعة الذباب الفردية في غرف صغيرة غطت شريحة الغطاء لأداء optogenetics.
في غرفة مظلمة، تنفيذ بروتوكول يتكون من 30 ثانية حيث الضوء الأحمر غائب، تليها 10 ثانية من التعرض للضوء الأحمر في 10 هيرتز. كرر هذا الإجراء ثلاث مرات في المجموع متبوعاً بفاصل زمني إضافي 30 ثانية حيث يكون الضوء الأحمر غير موجود. جمع الذباب الفردية من كل غرفة على منصات ثاني أكسيد الكربون.
لإخضاعهم لإصابة هوائية، اختصر كل من شرائح الهوائي الثاني اليسرى والأيمانية. هذا يزيل الأجسام الخلية من الخلايا العصبية الجهاز جونستون في حين أن التوقعات المحورية لا تزال في الجهاز العصبي المركزي. استعادة الذباب في قارورة مغطاة الألومنيوم التي تحتوي على 200 ملليمولار جميع عبر شبكية العين.
في نقاط الوقت المقابلة، على سبيل المثال سبعة أيام بعد استئصال الهوائي، واخضاع الذباب إلى آخر الاستمالة المقايسة. في هذا البروتوكول، تم تقديم ثلاث طرق لدراسة مورفولوجيا ووظيفة المحاور المقطوعة واشتباكاتها العصبية. الطريقة الأولى تسمح لمراقبة عالية الدقة من محاور عصبية الفردية في الجهاز العصبي المحيطي.
تظهر هنا الصلبان التخطيطية لتوليد الحيوانات المستنسخة من النوع البري و عالية الأسلاك في الجناح. كما تُعرض السيطرة على المحاور التي تحمل علامات GFP المصابة بسهام تشير إلى وجود محاور مُقطعة. يتم تقديم النهج الثاني لدراسة موت محور عصبي من GFP المسمى محاور عصبية حسية في الدماغ.
تظهر هنا الصلبان التخطيطية لتوليد الحيوانات المستنسخة من النوع البري و عالية الأسلاك في الدماغ. وتقدم أمثلة على السيطرة في أجهزة المحاور المصابة التي تحمل علامة GFP مع السهام التي تشير إلى حزم محور عصبي مقطوعة. الطريقة الثالثة يوضح نهج لتصور وظيفة عصبي وتشابكي بعد axotomy.
يظهر هنا الصلبان التخطيطية لتوليد من النوع البري وdnmnat الإفراط في التعبير عن الخلايا العصبية الحسية الجهاز جونستون. الذباب البري من النوع الذباب يحتوي على الخلايا العصبية الأعضاء جونستون مع موت محور عصبي مخفف. كلاهما كان يضمر سلوك استمالة قوي قبل الإصابة.
ومع ذلك ، سبعة أيام بعد الإصابة ، الاستمالة فشلت في الحصول عليها من قبل optogenetics في الذباب من النوع البري ، في حين أن الحيوانات ذات موت محور عصبي مخفف استمرت في الاستمالة. هنا نستخدم فقدان الطفرات الدالة أو تعبيرنا عن الجينات لمراقبة الحفاظ على مورفولوجيا المحور المحوري أو الدالة متشابك. يمكن تطبيق طرق تعديل أخرى، مثل إسقاط تدخل الحمض النووي الريبي أو أنسجة محددة CRISPR-Cas9 بوساطة طرق.
يمكن استخدام هذه الطرق في سياق إصابة مستقلة. أنها تسمح لمراقبة وتوصيف عوامل الصيانة العصبية أثناء الشيخوخة, نقل محور عصبي, وعضيات محور عصبي في محاور عصبية سليمة.
