Bu Drosophila yaralanma protokolünün genel amacı aksonal ve sinaptik morfolojinin korunması, aksonların sinaptik fonksiyonu ve sinapsları gözlemlemektir. Bu tahliller aynı zamanda nöronal bakım faktörleri karakterize etmek için kullanılabilir, çalışma aksonal taşıma, ya da bozulmamış aksonlarda aksonal organelleri analiz. Kısmi kanat yaralanması tsömonisi, Drosophila kanadında aynı sinir demeti içinde yaralanmamış kontrol aksonları ile yan yana dejenerasyon geçiren yaralı aksonların gözlemlenmesini sağlar.
Bu yaralanma tsay kolayca mikro-makas ile kanadın ortasında kabaca bir kesim uygulayarak vahşi tipi sinekler önceden uygulanabilir. Dahili yaralanma aksonal morfolojinin değerlendirilmesi ve akson ve sinapsların fonksiyonel korunmasını görselleştirmek için optogenetik kullanımı ile sağlar. Anten ablasyon sabit eller gerektirir.
Ayrıca önceden yabani tip sinekler anten kaldırma uygulama önerilir. Bağımlılık, herhangi bir mevcut optogenetik kurulum şapka ile sinek nöronlar etkinleştirmek için uygundur. Aksi takdirde, basit bir kurulum kolayca sıfırdan inşa edilebilir.
Başlamak için, oda sıcaklığında haçlar gerçekleştirmek için sağ genotip beş bakire kadın ve beş erkek kullanın. P0 neslini her 3-4 günde bir yeni şişelere aktarın. Yeni şişeler içine taze eclosed yetişkin nesil F1 nesil günlük toplamak ve yedi ila 14 gün boyunca onları yaş.
Anesteziden sonra, kanat ortasında kabaca iç kanat damarkesmek için mikro makas kullanın. Yaralanma için bir kanat ve bir yaş yaralanmamış kontrol eşleşen olarak diğer kanat kullanın. Kanat başına bir sakatlık uygulayın ve 15 kanat yaralı almak için emin olun.
Şişeiçeren yiyeceklerdeki sinekleri kurtarın. Sonra, bir pipet ile, bir bütün cam slayt boyunca halokarbon yağı 27 10 mikrolitre yayıldı. Bir ya da yedi gün sonra yaralanma, yaralı yanı sıra yaralanmamış kontrol kanadı kesmek için mikro makas kullanın.
Merkezdeki kanadı kapmak için cımbız kullanın, halokarbon yağı 27'ye maksimum dört kanat monte edin ve üzerini bir kapak kaydırağıyla kapatın. Kanattaki GFP etiketli nöronların görüntüleri dönen bir diskle kolayca elde edilebilir. Ancak, çanak sabit değildir, çünkü satın alma süresi kanatları monte sonra en az sekiz dakika içinde yapılmalıdır.
Dönen bir disk mikroskobu kullanarak kanadı hemen görüntüleyin. 0,33 mikrometre adım boyutuile Z ekseni boyunca bir dizi optik bölüm edinin ve sonraki analizler için Z-yığınlarını tek bir dosyaya sıkıştırın. Sağ genotipten beş bakire dişi ve beş erkek çapraz ve daha önce olduğu gibi F1 nesil toplamak.
Anesteziden sonra, tek taraflı ablasyon için sağ üçüncü anten segmentini veya bilateral ablasyon için hem sol hem de sağ üçüncü anten segmentlerini gizlemek için cımbız kullanın. Bu onların aksonal projeksiyonlar CNS kalır ise GFP etiketli nöronal hücre organları kaldırır. Teknikte kullanılan GFP etiketli nöronlara bağlı olarak, hücre gövdelerinin sonraki yaralanma tadına göre üçüncü veya ikinci anten segmentinde mi barındırılan olduğunu bilmek önemlidir.
Şişeiçeren yiyeceklerdeki sinekleri kurtarın. Anesteziden sonra, toraks düzeltmek için boyun ve başka bir cımbız kapmak için cımbız kullanın. Yavaşça boynunu çekin ve göğüs kapalı kafa.
Sabitleme çözeltisine batırılmış cımbız kullanarak, tüm kafaları pbs'de %4 paraformaldehit ve 0,1 triton X100 sabitleme çözeltisi içeren 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Oda sıcaklığında hafif ajitasyon ile 20 dakika başlarını düzeltin. Sonra mikrosantrifüj tüpbuz koymak ve kafaları microcentrifuge tüp altına çekilmek.
Bir pipet ile supernatant çıkarın ve PBS% 0.1 triton X100 içeren yıkama tampon bir mililitre ekleyin. İki dakika yıkamak için oda sıcaklığında bir tornalama tekerleği üzerine tüp yerleştirin. Artık sabitleme çözümünü kaldırmak için yıkamayı dört kez daha tekrarlayın.
Beyinleri hazırladıktan sonra, bir kapak slayt elde, üzerine laboratuvar bandı sopa, ve bant tan t gibi bir şekil kesip. Ucun üç milimetresinin kesildiği 20 ila 200 mikrolitrelik pipet ucunu kullanarak pipetin açılmasını genişletin. Pipet slayt üzerine antifade reaktif içeren beyin ve bir kapak slayt ile beyin kapağı.
İki küçük eşit rulo hazırlamak için kil kullanın. Kil rulobir cam slayt yüksekliği daha yüksek olmadığından emin olun. Cam slayt üzerine kil rulo sopa ve kil rulo üzerine kapak slayt sandviç içeren beyin yerleştirin.
El yazmasına göre devam et. Sinekleri optogenetik için hazırlamak için önce mikrodalgada sinek leri eritin. Gıda soğuduktan sonra, katılaşmadan önce, 200 mikromolar son konsantrasyona etanol tüm trans-Retinal ekleyin.
İyi bir şekilde karıştırın ve hemen boş şişelere gıda dökün. Fişler veya pamuk topları ile katılaşmış gıda içeren şişeleri kaplayın. Alüminyum folyo ile şişeleri sarın.
Daha sonra, koyu soğuk bir odada şişeler içeren gıda saklayın. Oda sıcaklığında haçlar gerçekleştirmek ve daha önce 200 mikromolar tüm trans-Retinal içeren alüminyum kaplı şişeler daha önce sinek gıda trans-Retinal içeren F1 nesil toplamak için doğru genotip beş bakire kadın ve beş erkek kullanın. Daha sonra, hiçbir gıda ile boş bir şişe içine şişeleri içeren gıda dokunarak sinektoplamak.
Şişeyi yaklaşık 30 saniye boyunca su içeren buzda soğutun. Sinekler uykuya dalar. Şimdi, hızla küçük odalara bireysel sinekkoymak optogenetik gerçekleştirmek için bir kapak slayt kaplı.
Karanlık bir odada, kırmızı ışığın olmadığı 30 saniyeden oluşan protokolü uygulayın ve ardından 10 Hertz'de 10 saniye lik kırmızı ışığa maruz kalarak. Kırmızı ışığın olmadığı 30 saniyelik ek bir aralık la bu yordamı toplamda üç kez tekrarlayın. Karbondioksit pedleri üzerinde her odadan ayrı sinektoplamak.
Anten yaralanmasına maruz kalmak için hem sol hem de sağ ikinci anten segmentlerini temizleyin. Aksonal projeksiyonlar CNS kalır bu johnston organ nöronlarının hücre organları kaldırır. Tüm trans-Retinal 200 milimolar içeren alüminyum kaplı şişeler içinde sinekkurtarmak.
Karşılık gelen zaman noktalarında, örneğin yedi gün sonrası anten ablasyon, başka bir tımar tofçuk sinek tabi. Bu protokolde, kopmuş aksonların ve sinapslarının morfolojisi ve işlevini incelemek için üç yöntem sunulmuştur. İlk yöntem periferik sinir sisteminde bireysel aksonların yüksek çözünürlüklü gözlem sağlar.
Kanatta yabani tip ve highwire klonlar oluşturmak için şematik haçlar burada gösterilmiştir. Yaralı GFP etiketli aksonlar kontrol de kopmuş aksonlar gösteren oklar ile sunulmaktadır. Beyinde duyusal nöron aksonları etiketli GFP akson ölüm çalışma için ikinci yaklaşım sunulmaktadır.
Şematik haçlar beyinde yabani tip ve highwire klonlar oluşturmak için burada gösterilmiştir. Yaralı GFP etiketli aksonlarkontrol örnekleri kopmuş akson demetleri gösteren oklar ile sunulmaktadır. Üçüncü yöntem aksotomi sonrası aksonal ve sinaptik fonksiyonu görselleştirme yaklaşımını göstermektedir.
Johnston'ın organ duyusal nöronlarını aşırı ifade eden yabani tip ve dnmnat üretmek için şematik haçlar burada gösterilmiştir. Vahşi sinekler Johnston'ın organ nöronlarını içeren ve zayıflatılmış akson ölümü olan sineklerdir. Her ikisi de yaralanmadan önce güçlü bir tımar davranışı barındıran.
Ancak, yaralanma dan yedi gün sonra, tımar yabani tipi sineklerde optogenetik tarafından ortaya çıkarılamadı, zayıflatılmış akson ölüm ile hayvanlar damat devam ederken. Burada aksonal morfolojinin veya sinaptik fonksiyonun korunmasını gözlemlemek için fonksiyon mutasyonlarının kaybını veya genleri ifade mizi kullanıyoruz. RNA girişimini veya dokuya özgü CRISPR-Cas9 aracılı nakavtlarını yıkmak gibi diğer değiştirme yöntemleri uygulanabilir.
Bu yöntemler bir yaralanma bağımsız bağlamda kullanılabilir. Onlar gözlem ve yaşlanma sırasında nöronal bakım faktörlerinin karakterizasyonu için izin, aksonal taşıma, ve aksonal organeller bozulmamış aksonlar.
