המטרה הכוללת של פרוטוקול פציעה דרוסופילה זה היא לבחון הן את השימור של מורפולוגיה אקסונאלית סינפטית, כמו גם תפקוד סינפטי של אקסונים הסינפסות שלהם. אלה assays יכול לשמש גם כדי לאפיין גורמי תחזוקה עצביים, ללמוד תחבורה אקסונלית, או לנתח organelles אקסונאלי האקסונים שלמים. הפציעה החלקית בכנף מאפשרת תצפית של אקסונים פצועים שעוברים ניוון זה לצד זה עם אקסונים שליטה לא פצועים בתוך אותו צרור עצבים באגף דרוסופילה.
בדיקה פציעה זו ניתן לתרגל בקלות מראש זבובים מסוג פראי על ידי החלת חתך בערך באמצע הכנף עם מיקרו מספריים. הפגיעה הפנימית מאפשרת הערכה של מורפולוגיה אקסונאלית ועל ידי שימוש באופטוגנטיקה כדי לדמיין שימור תפקודי של אקסון והתקצירים שלהם. אבלציה של אנטנות דורשת ידיים יציבות.
מומלץ גם לתרגל את הסרת האנטנות בזבובים מסוג פראי מראש. בהתמכרות, כל התקנה אופטוגנטיקה זמינה מתאימה להפעלת הנוירונים לטוס עם כובע. אחרת, התקנה פשוטה יכולה להיבנות בקלות מאפס.
כדי להתחיל, השתמש חמש נקבות בתולה וחמישה זכרים מן הגנוטיפ הנכון לבצע צלבים בטמפרטורת החדר. העבר את דור ה-P0 לבקבוקונים חדשים כל שלושה עד ארבעה ימים. לאסוף דור F1 מבוגר eclosed טרי מדי יום לתוך בקבוקונים חדשים גיל אותם במשך שבעה עד 14 ימים.
לאחר הרדמה, השתמש במיקרו מספריים כדי לחתוך את וריד הכנף הפנימי בערך באמצע הכנף. השתמש בכנף אחת לפציעה ובאגף השני כגיל תואם שליטה לא פצועה. יש למרוח פציעה אחת בכל כנף ולוודא ש-15 כנפיים נפצעו.
לשחזר את הזבובים במזון המכיל בקבוקונים. לאחר מכן, עם פיפטה, להפיץ 10 microliters של שמן halocarbon 27 לאורך מגלשת זכוכית שלמה. יום או שבעה ימים לאחר פציעה, השתמש במיקרו-מספריים כדי לנתק את הפצועים, כמו גם את כנף הבקרה הבלתי פצועה.
השתמש פינצטה לתפוס את הכנף במרכז, הר מקסימום ארבע כנפיים לתוך שמן halocarbon 27 ולכסות אותם עם מגלשת כיסוי. תמונות של נוירונים המסווים GFP בכנף ניתן לרכוש בקלות עם דיסק מסתובב. עם זאת, זמן הרכישה צריך להתבצע בתוך פחות משמונה דקות לאחר הרכבה על הכנפיים כי המנה אינה קבועה.
תדמיין את הכנף מיד באמצעות מיקרוסקופ דיסק מסתובב. רכוש סדרה של מקטעים אופטיים לאורך ציר Z עם גודל צעד 0.33 מיקרומטר ודחוס ערימות Z לקובץ יחיד לניתוחים הבאים. לחצות חמש נקבות בתולות וחמישה זכרים מהגנוטיפ הנכון ולאסוף דור F1 כבעבר.
לאחר הרדמה, השתמש פינצטה כדי להפוך את קטע האנטנות השלישי הימני עבור אבלציה חד צדדית או שני מקטעי אנטנות שלישית שמאלה וימינה עבור אבלציה דו-צדדית. פעולה זו מסירה GFP שכותרתו גופי תאים עצביים בעוד התחזיות האקסונאליות שלהם להישאר מערכת העצבים המרכזית. בהתאם לנוירונים המסומן GFP המשמשים בטכניקה, חשוב לדעת אם גופי התא שוכנים בשלישי או במקטע האנטנה השני לצורך הפציעה הבאה.
לשחזר את הזבובים במזון המכיל בקבוקונים. לאחר הרדמה, השתמש פינצטה לתפוס את הצוואר פינצטה נוספת כדי לתקן את בית החזה. משוך בעדינות את הצוואר ואת הראש את בית החזה.
באמצעות פינצטה כי כבר טבול לתוך פתרון התיקון, להעביר את כל הראשים לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר המכיל מיליליטר אחד של פתרון תיקון של 4%paraformaldehyde ו 0.1 טריטון X100 ב PBS. תקן את הראשים במשך 20 דקות עם תסיסה עדינה בטמפרטורת החדר. ואז לשים את צינור microcentrifuge על קרח ואת הראשים נמשכים לתחתית צינור microcentrifuge.
הסר את העל-טבעי עם פיפטה והוסף מיליליטר אחד של מאגר כביסה המכיל 0.1% טריטון X100 ב- PBS. מניחים את הצינור על גלגל מסתובב בטמפרטורת החדר כדי לשטוף במשך שתי דקות. חזור על לשטוף ארבע פעמים נוספות כדי להסיר פתרון תיקון שיורית.
לאחר הכנת המוח, להשיג שקופית כיסוי, לתקוע קלטת מעבדה על זה, ולגזור צורה כמו T מהקלטת. השתמש 20 כדי 200 טיפ פיפטה microliter שבו שלושה מילימטרים של הקצה נותק כדי להרחיב את הפתיחה של פיפטה. פיפטה המוח המכיל reagent antifade על השקופית ולכסות את המוח עם שקופית כיסוי.
השתמש חימר להכין שני לחמניות אפילו קטנות. ודא כי לחמניות חימר אינם גבוהים יותר מגובה של מגלשת זכוכית. תקע את גלילי החימר על מגלשת הזכוכית והצב את המוח המכיל כריך שקופיות כיסוי על לחמניות החימר.
המשך בהתאם לכתב היד. כדי להכין את הזבובים לאופטוגנטיקה, ראשית להמיס מזון זבוב במיקרוגל. לאחר שהמזון מתקרר, לפני ההתמצמות, מוסיפים 20 מילימולר כל טרנס-רטינאלי באתנול לריכוז סופי של 200 מיקרומולר.
מערבבים היטב ויוצקים את האוכל מיד לתוך בקבוקונים ריקים. מכסים את הבקבוקונים המכילים את האוכל המוצק בתקעים או כדורי כותנה. עוטפים את הבקבוקונים בנייר אלומיניום.
לאחר מכן, לאחסן את האוכל המכיל בקבוקונים בחדר קר כהה. השתמש חמש נקבות בתולה וחמישה זכרים מן הגנוטיפ הנכון לבצע צלבים בטמפרטורת החדר ולאסוף דור F1 כמו בעבר בקבוקונים מכוסים אלומיניום המכיל 200 micromolar כל trans-Retinal במזון זבוב. לאחר מכן, לאסוף את הזבובים על ידי הקשה עליהם ממזון המכיל בקבוקונים לתוך בקבוקון ריק ללא מזון.
מקררים את הבקבוקון בקרח המכיל מים למשך כ-30 שניות. זבובים נרדמים. עכשיו, במהירות לשים זבובים בודדים לתוך תאים קטנים מכוסה שקופית כיסוי לבצע אופטוגנטיקה.
בחדר חשוך, בצע את הפרוטוקול המורכב 30 שניות שבו האור האדום נעדר, ואחריו 10 שניות של חשיפה לאור אדום ב 10 הרץ. חזור על הליך זה שלוש פעמים בסך הכל ואחריו מרווח נוסף של 30 שניות שבו האור האדום נעדר. לאסוף זבובים בודדים מכל תא על רפידות פחמן דו חמצני.
כדי לחשוף אותם לפגיעה באנטנות, יש להפוך הן את מקטעי האנטנות השמאלית והן את מקטעי האנטנה השניים הימניים. זה מסיר את גופי התא של נוירוני האיברים של ג'ונסטון בעוד התחזיות האקסונאליות נשארות ב- CNS. לשחזר את הזבובים בבקבוקונים מכוסים אלומיניום המכיל 200 מילימולר כל טרנס-רשתית.
בנקודות זמן מקבילות, למשל שבעה ימים לאחר אבלציה אנטנות, לחשוף את הזבובים לתחת טיפוח אחר. בפרוטוקול זה הוצגו שלוש שיטות לחקר המורפולוגיה והתפקוד של אקסונים כרותים ואת הסינפסות שלהם. השיטה הראשונה מאפשרת תצפית ברזולוציה גבוהה של אקסונים בודדים במערכת העצבים ההיקפית.
הצלבים סכמטיים כדי ליצור שיבוטים מסוג פראי highwire בכנף מוצג כאן. השליטה באקסונים פצועים עם תווית GFP מוצגים גם עם חצים המציינים אקסונים כרותים. הגישה השנייה לחקר מוות אקסון של GFP שכותרתו אקסונים נוירון חושי במוח מוצג.
צלבים סכמטיים כדי ליצור שיבוטים מסוג פראי ו highwire במוח מוצג כאן. דוגמאות לשליטה באקסונים בעלי תווית GFP פצועה מוצגות עם חצים המציינים חבילות אקסון מנותקות. השיטה השלישית מדגימה את הגישה לדמיין פונקציה אקסונאלית וסינאפטית לאחר אקסוטומיה.
הצלבים סכמטיים כדי ליצור סוג פראי ו dnmnat מעל להביע נוירונים חושיים איברים של ג'ונסטון מוצג כאן. זבובים מסוג פראי הם זבובים המכילים את תאי העצב באיברים של ג'ונסטון עם מוות אקסון מקוצר. שניהם היו בעלי התנהגות טיפוח חזקה לפני פציעה.
עם זאת, שבעה ימים לאחר פציעה, הטיפוח לא עורר אופטוגנטיקה בזבובים מסוג בר, בעוד בעלי החיים עם מוות אקסון מקוצר המשיכו לטפח. כאן אנו משתמשים באובדן מוטציות תפקודיות או בביטוי הגנים שלנו כדי לבחון את שימור המורפולוגיה האקסונאלית או התפקוד הסינפטי. ניתן ליישם שיטות שינוי אחרות, כגון הפרעת RNA או נוקאאוטים מתווכים ספציפיים לרקמות CRISPR-Cas9.
ניתן להשתמש בשיטות אלה בהקשר בלתי תלוי בפציעה. הם מאפשרים תצפית ואפיון של גורמי תחזוקה עצביים במהלך ההזדקנות, הובלה אקסונלית, ואברונים אקסונאליים באקסונים שלמים.
