O objetivo geral deste protocolo de lesão de Drosophila é observar tanto a preservação da morfologia axonal e sináptica, bem como a função sinapática dos axônios e suas sinapses. Esses ensaios também podem ser usados para caracterizar fatores de manutenção neuronal, estudar o transporte axonal ou analisar organelas axonais em axônios intactos. O ensaio parcial de lesão da asa permite a observação de axônios feridos submetidos à degeneração lado a lado com axônios de controle ilesos dentro do mesmo feixe nervoso na asa de Drosophila.
Este ensaio de lesão pode ser facilmente praticado de antemão em moscas do tipo selvagem, aplicando um corte aproximadamente no meio da asa com micro-tesouras. A lesão interna permite a avaliação da morfologia axonal e pelo uso de optogenética para visualizar a preservação funcional do axônio e suas sinapses. A ablação das antenas requer mãos firmes.
Também é recomendado praticar a remoção das antenas em moscas do tipo selvagem de antemão. No vício, qualquer configuração optogenética disponível é adequada para ativar os neurônios em mosca com chapéu. Caso contrário, uma configuração simples pode ser prontamente construída do zero.
Para começar, use cinco fêmeas virgens e cinco machos do genótipo direito para realizar cruzes à temperatura ambiente. Transfira a geração P0 para novos frascos a cada três ou quatro dias. Colete a geração de F1 de descendentes adultos recém-fechada diariamente em novos frascos e envelhe nas partes de sete a 14 dias.
Após a anestesia, use micro-tesoura para cortar a veia da asa interior aproximadamente no meio da asa. Use uma asa para a lesão e a outra asa como uma idade combinada com o controle ileso. Aplique uma lesão por asa e certifique-se de ter 15 asas feridas.
Recupere as moscas em alimentos contendo frascos. Em seguida, com uma pipeta, espalhe 10 microliters de óleo de halocarboneto 27 ao longo de uma lâmina de vidro inteira. Um ou sete dias após a lesão, use micro-tesoura para cortar os feridos, bem como a asa de controle não ferida.
Use pinças para agarrar a asa no centro, montar quatro asas máximas no óleo de halocarboneto 27 e cobri-las com um slide de cobertura. Imagens de neurônios rotulados gfp na asa podem ser prontamente adquiridas com um disco giratório. No entanto, o tempo de aquisição deve ser realizado em menos de oito minutos após a montagem das asas, pois o prato não está fixo.
Imagem a asa imediatamente usando um microscópio de disco giratório. Adquira uma série de seções ópticas ao longo do eixo Z com tamanho de passo de 0,33 micrômetros e compresse as pilhas Z em um único arquivo para análises subsequentes. Cruze cinco fêmeas virgens e cinco machos do genótipo certo e colete a geração F1 como anteriormente.
Após a anestesia, use pinças para oblar o terceiro segmento de antena direita para ablação unilateral ou segmentos de terceiros antenas esquerdo e direito para ablação bilateral. Isso remove corpos de células neuronais rotulados por GFP enquanto suas projeções axonais permanecem no CNS. Dependendo dos neurônios rotulados gfp usados na técnica, é importante saber se os corpos celulares estão alojados no terceiro ou no segundo segmento antena para o ensaio de lesão subsequente.
Recupere as moscas em alimentos contendo frascos. Após a anestesia, use pinças para agarrar o pescoço e outra pinça para consertar o tórax. Puxe suavemente o pescoço e a cabeça para fora do tórax.
Usando pinças que foram mergulhadas na solução de fixação, transfira todas as cabeças para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo um mililitro de solução de fixação de 4% paraformaldeído e 0,1 triton X100 em PBS. Conserte as cabeças por 20 minutos com agitação suave à temperatura ambiente. Em seguida, coloque o tubo de microcentrifuge no gelo e as cabeças gravitam para o fundo do tubo de microcentrifutura.
Remova o supernasal com uma pipeta e adicione um mililitro de tampão de lavagem contendo 0,1% triton X100 em PBS. Coloque o tubo em uma roda giratória à temperatura ambiente para lavar por dois minutos. Repita a lavagem mais quatro vezes para remover a solução de fixação residual.
Depois de preparar o cérebro, obtenha um slide de cobertura, coloque fita de laboratório nele, e corte uma forma de T da fita. Use uma ponta de pipeta de 20 a 200 microliter onde três milímetros da ponta foi cortada para ampliar a abertura da pipeta. Pipeta o cérebro contendo reagente antifade no slide e cobrir o cérebro com um slide de cobertura.
Use argila para preparar dois pequenos rolos uniformes. Certifique-se de que os rolos de argila não são mais altos do que a altura de um deslizamento de vidro. Coloque os rolos de argila no escorregador de vidro e coloque o cérebro contendo sanduíche de deslizamento de cobertura nos rolos de argila.
Prossiga de acordo com o manuscrito. Para preparar as moscas para optogenética, primeiro derreter comida de mosca em um micro-ondas. Depois que o alimento esfriar, antes da solidificação, adicione 20 milimões de toda trans-Retinal no etanol a uma concentração final de 200 micromolar.
Misture bem e despeje a comida imediatamente em frascos vazios. Cubra os frascos que contenham os alimentos solidificados com plugues ou bolas de algodão. Enrole os frascos com papel alumínio.
Em seguida, armazene os alimentos contendo frascos em uma sala fria escura. Use cinco fêmeas virgens e cinco machos do genótipo direito para realizar cruzes à temperatura ambiente e coletar a geração F1 como anteriormente em frascos cobertos de alumínio contendo 200 micromolars todos trans-Retinal em alimentos de mosca. Em seguida, recolhe as moscas batendo-as de alimentos contendo frascos em um frasco vazio sem comida.
Esfrie o frasco em gelo contendo água por aproximadamente 30 segundos. Moscas adormecem. Agora, rapidamente coloque moscas individuais em pequenas câmaras cobriu um slide de cobertura para executar optogenética.
Em uma sala escura, execute o protocolo que consiste em 30 segundos onde a luz vermelha está ausente, seguido por 10 segundos de exposição à luz vermelha a 10 Hertz. Repita este procedimento três vezes no total seguido de um intervalo adicional de 30 segundos onde a luz vermelha está ausente. Recolher moscas individuais de cada câmara em almofadas de dióxido de carbono.
Para subsiá-los a lesões antenais, ablto tanto os segmentos de antena esquerda quanto direita. Isso remove os corpos celulares dos neurônios do órgão de Johnston enquanto as projeções axonais permanecem no CNS. Recupere as moscas em frascos cobertos de alumínio contendo 200 mililitros de trans-Retinal.
Em pontos de tempo correspondentes, por exemplo, sete dias após ablação de antenas, sujeitar as moscas a outro ensaio de preparação. Neste protocolo, foram apresentados três métodos para estudar a morfologia e a função dos axônios decepados e suas sinapses. O primeiro método permite a observação de alta resolução de axônios individuais no sistema nervoso periférico.
As cruzes esquemáticas para gerar clones de tipo selvagem e highwire na asa são mostradas aqui. Os axônios rotulados GFP também são apresentados com setas indicando axônios decepados. A segunda abordagem para estudar a morte axon de Axons rotulados de GFP no cérebro é apresentada.
Cruzes esquemáticas para gerar clones de tipo selvagem e highwire no cérebro é mostrado aqui. Exemplos de controle em axônios rotulados GFP feridos são apresentados com setas indicando feixes de axônio cortados. O terceiro método demonstra a abordagem para visualizar a função axonal e sináptica após a axotomia.
As cruzes esquemáticas para gerar tipo selvagem e dnmnat super-expressando os neurônios sensoriais de órgãos de Johnston é mostrado aqui. Moscas selvagens são moscas contendo neurônios de órgãos de Johnston com morte axon atenuada. Ambos abrigavam um potente comportamento de preparação antes da lesão.
No entanto, sete dias após a lesão, o preparo não foi provocado pela optogenética em moscas selvagens, enquanto os animais com morte atenuada de axon continuaram a se preparar. Aqui usamos a perda de mutações de função ou nossa expressão de genes para observar a preservação da morfologia axonal ou função sináptica. Outros métodos modificados podem ser aplicados, como derrubar a interferência do RNA ou os knock outs mediados crispr-Cas9 específicos do tecido.
Estes métodos podem ser usados em um contexto independente de lesões. Permitem a observação e caracterização de fatores de manutenção neuronal durante o envelhecimento, transporte axonal e organelas axonais em axônios intactos.
