في التفاعلات البروتينية البروتينية في الجسم الحي FPOP وتغيرات بنية البروتين في C-elegans. وتستخدم هذه الحيوانات على نطاق واسع كنظام نموذجي لدراسة الأمراض البشرية. عن طريق اقتران في الجسم الحي FPOP لقياس الطيف الشامل، يمكننا التحقيق البروتين البروتين التفاعلات داخل مختلف مقصورات الخلوية والجسم في حي دون الحاجة إلى عزل بروتين واحد معين.
بدء تجميع نظام التدفق، عن طريق قطع قطعة سنتيمترين من البروبيلين الإثيلين المفلورة أو أنابيب FPP. استخدام إبرة تشريح نظيفة لتوسيع القطر الداخلي في نهاية واحدة من الأنابيب، وخلق حفرة صغيرة حوالي 15 ملليمتر في الطول. لإنشاء خطوط الضخ لنظام التدفق، وقطع إلى 15 قطعة سنتيمتر من 250 ميكرومتر الداخلية قطر تنصهر السيليكا مع قطع السيراميك.
وشريط الشعيرات الدموية اثنين جنبا إلى جنب مع شريط لاصق الذاتي، والتأكد من أن نهايات هي 100٪ مسح. أدخل الشعيرات الدموية في فوهة فوهة أنابيب FPP ، ودفعها إلى الحافة ذاتها. ضع نقطة صغيرة من راتنج الايبوكسي على سطح نظيف ، واخلطها مع إبرة التشريح.
استخدام نفس الإبرة لوضع بسرعة قطرة صغيرة من الراتنج، في نهاية الشعيرات الدموية الضخ، حيث أنها تتصل مع أنابيب FPP، والسماح للراتنج لتجفيف الجانب منفذ لبضع دقائق. وفي الوقت نفسه، وقطع جديد 250 ميكرومتر الداخلية قطر الشعيرية التي سوف تصبح الشعيرية منفذ من نظام التدفق. مرة واحدة وقد جفت الراتنج، إدراج شعري جديد إلى منفذ أنابيب FPP نهاية.
يجب أن يكون الطرفين الداخليين للشعييري المتنفس والشعيرات الشعرية المُغرِقتين دافقًا ضد بعضهما البعض، مما يخلق الشاي المُخلط. ربط إلى شعري وFPP الأنابيب مع راتنج الايبوكسي الطازجة كما هو موضح سابقا، والسماح لنظام تدفق لتجف بين عشية وضحاها. إدراج أربعة ستيررس المغناطيسي، داخل حقنة واحدة خمسة ملليلتر التي سوف تمنع الديدان من الاستقرار في هذه الحقنة خلال في في أكسدة حيوية ضوئية سريعة من البروتينات أو في FPOP vivo.
ملء هذا ومحاقن إضافية خمسة ملليلتر مع M9، مع التأكد من تجنب خلق فقاعات. قم بتوصيل محول أقل بكل حقنة، مع التأكد من أنها ضيقة ومؤمنة في مكانها. ثم، تعلق كل حقنة إلى المنفذ الأوسط من صمام واحد ثلاثة-اثنين.
تأمين كل حقنة إلى مضخة حقنة مزدوجة، وضبط اللون الميكانيكي لمنع الضغط الزائد من كتلة دافع. استخدام قائمة شفة فائقة لا FEP الأكمام و السوبر شفة قائمة متغير لإرفاق كل نهاية شعرية غرس من نظام microfluidic التي قدمت سابقا إلى المنفذ العلوي من كل صمام ثلاثة-اثنين. وأخيراً، نعلق 10 سنتيمتر 450 ميكرومتر الشعرية الداخلية القطر إلى المنفذ السفلي للصمام، والتي سوف تكون بمثابة الشعرية عينة سحب.
بدء تدفق المضخة وفحص بصريا جميع الاتصالات للتسربات. تدفق ما لا يقل عن ثلاثة وحدات تخزين المحاقن باستخدام معدل التدفق التجريبي. يتم وضع علامة على مسار التدفق من الأسهم على مقبض الصمام ثلاثة-اثنين، ويمكن إعادة ملء كل حقنة يدويا عن طريق تحريك مقبض صمام من طرد إلى موقف الانسحاب.
بعد فحص نظام تدفق microfluidic، نقله إلى مقاعد البدلاء التجريبية، وتأمين الشعرية منفذ إلى مرحلة تشع مع اتحاد الفولاذ المقاوم للصدأ. استخدام أخف مدى طويل لحرق طلاء السيليكا تنصهر في نافذة أشعة الليزر وتنظيف الطلاء المحروق مع أنسجة الوبر والميثانول. ضع كتلة التحريك المغناطيسي فوق المحقنة مع التحريك المغناطيسي وضبط السرعة ، بحيث تدور التحريكات ببطء وباستمرار.
بدوره على الكريبتون الفلورايد excimer الليزر والسماح للتروين الغدة الدرقية للاحماء. قياس طاقة الليزر على تردد 50 هيرتز لمدة لا تقل عن 100 نبضة عن طريق وضع جهاز الاستشعار البصري في نافذة خروج شعاع. سحب يدويا حوالي 10،000 الديدان في حجم 500 ميكرولتر في حقنة العينة.
ثم تعبئة مع 2.5 ملليلتر من المخزن المؤقت M9، مع التأكد من تجنب فقاعات الهواء. من المهم أن يكون حجم عينة لا يقل عن 10000 الديدان. وسوف يؤدي حجم عينة أصغر في انخفاض العائد البروتين لتحليل البروتيوم المصب.
ملء الحقنة الثانية مع ثلاثة ملليلتر من 200 ميليمولار بيروكسيد الهيدروجين. في نهاية شعرية منفذ, وضع أنبوب مخروطي 15 ملليلتر مع ستة ملليلتر من 40 ملليمولار DMTU, 40 ميليمولار PBN, و 1٪ من وقت أكسيد التفاح. بدء الليزر excimer من نافذة البرنامج، والانتظار للنبض الأول وبدء تدفق العينة من حقنة مزدوجة.
جمع العينة بأكملها في أنبوب 15 ملليلتر، في حين تراقب بنشاط تدفق العينة لأي تسرب البصرية. بعد في vivo FPOP، بيليه الديدان عن طريق الطرد المركزي في 805 مرات ز لمدة دقيقتين. pirate محلول التبريد وإضافة 250 ميكرولترات من المخزن المؤقت المرخصة.
نقل العينة إلى أنبوب طرد مركزي صغير نظيفة، فلاش تجميده وتخزينها في درجة حرارة سالبة 80 درجة مئوية حتى هضم العينة. تم مقارنة استرداد دودة بعد في في الجسم الحي FPOP باستخدام الشعيرات الدموية مع اثنين من أقطار داخلية مختلفة. عندما تم استخدام شعرية قطرها الداخلي 250 ميكرومتر، تم تحقيق استعادة عينة إجمالية بين 63 و 89٪عبر اثنين من النسخ المتماثلة البيولوجية.
أدى استخدام 150 ميكرومتر داخلي قطر شعري في الانتعاش فقط 21 إلى 31٪. استخدام أكبر قطر داخلي شعرية، يؤدي إلى تدفق دودة أفضل خلال في FPOP في الجسم الحي، والشعيرات الدموية أصغر لا يسمح لتدفق دودة واحدة، وينظر الديدان متعددة تتدفق معا في نافذة الليزر يشع، مما يقلل من كمية التعرض بالليزر لكل دودة. الممثل استخراج الكروماتوغرافية الأيون من الببتيد FPOP المعدلة وغير المعدلة أظهرت أن الهيدروكسيل الجذرية التغييرات كيمياء الببتيدات المعدلة التأكسي مما يجعلها أكثر القطبية.
في عكس المرحلة الكروماتوغرافيا، في الببتيدات المعدلة FPOP vivo يكون وقت الاحتفاظ في وقت سابق من الببتيدات غير المعدلة. تفتيت التصلب المتعدد من الببتيدات المعزولة، ويسمح لتحديد المخلفات المعدلة التأسد. في في الجسم الحي FPOP قد عدلت التأديد ما مجموعه 545 البروتينات عبر اثنين من النسخ المتماثلة البيولوجية داخل C-elegans.
إحدى مزايا طريقة البصمة البروتينية هذه، هي قدرتها على تعديل البروتينات، في مجموعة متنوعة من أنظمة الجسم داخل الديدان. يؤكد تحليل MS الترادف في vivo FPOP التحقيق المذيبات في vivo. تم تحليل نمط الأكسدة من البروتين صدمة الحرارة 90 في مجمع مع البروتين المرافق myosin UNC 45، وعثر على أربع بقايا معدلة بشكل مؤكسد.
استخدام C-elegans لفي فيفو FPOP، ويوفر إمكانية لدراسة دور البروتين البروتين التفاعلات وبنية البروتين في الأمراض المسببة للأمراض.
