Interactions protéine-protéine FPOP in vivo et changements de structure protéique chez C-elegans. Ces animaux sont largement utilisés comme un système modèle pour étudier les maladies humaines. En couplant in vivo FPOP à la spectrométrie de masse, nous pouvons sonder les interactions protéine-protéine dans différents compartiments cellulaires et corporels chez un animal vivant sans avoir besoin d’isoler une protéine particulière.
Commencez l’assemblage du système d’écoulement, en coupant un morceau de deux centimètres de propylène d’éthylène fluoré ou de tube FPP. Utilisez une aiguille de dissecting propre pour élargir le diamètre intérieur à une extrémité du tube, créant un petit cratère d’environ 15 millimètres de longueur. Pour créer les lignes d’infusation du système d’écoulement, couper à 15 centimètres des morceaux de 250 micromètres de diamètre intérieur fondu silice avec un coupeur en céramique.
Et tapez les deux capillaires avec du ruban adhésif auto, en s’assurant que les extrémités sont rincées à 100%. Insérez les deux capillaires dans le cratère du tube FPP, en les poussant jusqu’au bord même. Placez un petit point de résine époxy sur une surface propre et mélangez-le avec l’aiguille disséquante.
Utilisez la même aiguille pour placer rapidement une petite goutte de résine, à l’extrémité des capillaires d’infusation, où ils se connectent avec le tube FPP, permettre à la résine de sécher côté sortie vers le haut pendant quelques minutes. Pendant ce temps, couper un nouveau capillaire de diamètre intérieur de 250 micromètres qui deviendra le capillaire de sortie du système d’écoulement. Une fois la résine séchée, insérez le nouveau capillaire à l’extrémité de sortie de tube FPP.
Les extrémités intérieures du capillaire de sortie et les deux capillaires d’infusation doivent être rincés l’un contre l’autre, créant le thé de mélange. Attachez-vous au tube capillaire et FPP avec de la résine époxy fraîche comme décrit précédemment, et laissez le système d’écoulement sécher pendant la nuit. Insérez quatre agitateurs magnétiques, à l’intérieur d’une seringue de cinq millilitres qui empêchera les vers de s’installer dans cette seringue lors de l’oxydation photochimique rapide in vivo des protéines ou in vivo FPOP.
Remplissez ceci et une seringue supplémentaire de cinq millilitres avec M9, en s’assurant d’éviter de créer des bulles. Connectez un adaptateur inférieur à chaque seringue, en vous assurant qu’elles sont serrées et fixées en place. Ensuite, fixez chaque seringue au port du milieu d’une seule vanne de trois-deux.
Fixez chaque seringue à la double pompe à seringues et ajustez la couleur mécanique pour éviter la surpression du bloc pousseur. Utilisez une liste de brides super pas fep manche et super flange liste variable pour attacher chaque extrémité capillaire infusant du système microfluidique précédemment fait au port supérieur de chaque vanne de trois-deux. Enfin, fixez un capillaire de 10 centimètres de diamètre intérieur de 450 micromètres au port inférieur de la vanne, qui servira d’échantillon capillaire de retrait.
Démarrez le flux de la pompe et inspectez visuellement toutes les connexions pour décexer les fuites. Coulez au moins trois volumes de seringues à l’aide du débit expérimental. La trajectoire d’écoulement est marquée par les flèches de la poignée de la vanne trois-deux, et chaque seringue peut être remplie manuellement en déplaçant la poignée de la vanne de l’expulsion à la position de retrait.
Après avoir inspecté le système d’écoulement microfluidique, déplacez-le sur le banc expérimental et fixez le capillaire de sortie au stade rayonnant avec une union en acier inoxydable. Utilisez un briquet de longue portée pour brûler le revêtement de la silice fondue à la fenêtre d’irradiation laser et nettoyer le revêtement brûlé avec du tissu de peluche et du méthanol. Placez le bloc d’agitateur magnétique au-dessus de la seringue avec les agitations magnétiques et ajustez la vitesse, de sorte que les agitations tournent lentement et constamment.
Allumez le laser excimer fluorure Krypton et laissez le tron thyroïdien se réchauffer. Mesurez l’énergie laser à une fréquence de 50 hertz pour au moins 100 impulsions en plaçant le capteur optique à la fenêtre de sortie du faisceau. Retirez manuellement environ 10 000 vers dans un volume de 500 microlitres dans la seringue de l’échantillon.
Remplissez-le ensuite de 2,5 millilitres du tampon M9, en vous assurant d’éviter les bulles d’air. Il est important d’avoir un échantillon d’au moins 10 000 vers. Une plus petite taille d’échantillon se traduira par un faible rendement en protéines pour l’analyse protéomique en aval.
Remplissez la deuxième seringue de trois millilitres de peroxyde d’hydrogène de 200 millimlaires. À la fin du capillaire de sortie, placez un tube conique de 15 millilitres avec six millilitres de DMTU de 40 millimlaires, 40 millimolar PBN, et 1% d’oxyde de compote de pommes. Démarrez le laser excimère à partir de la fenêtre logicielle, attendez la première impulsion et démarrez le flux d’échantillon à partir de la double seringue.
Recueillir l’échantillon entier dans le tube de 15 millilitres, tout en surveillant activement le débit de l’échantillon pour toute fuite visuelle. Après in vivo FPOP, pelleter les vers par centrifugation à 805 fois g pendant deux minutes. Aspirez la solution d’étanchéation et ajoutez 250 microlitres de tampon autorisé.
Transférer l’échantillon dans un tube de micro centrifugeuse propre, le congeler flash et le conserver à 80 degrés Celsius jusqu’à ce que l’échantillon soit digestion. La récupération de ver a été comparée après fpop in vivo utilisant des capillaires avec deux diamètres internes différents. Quand un capillaire de diamètre intérieur de 250 micromètres a été employé, une récupération totale d’échantillon entre 63 et 89% a été réalisée à travers deux répétitions biologiques.
L’utilisation d’un capillaire de diamètre intérieur de 150 micromètres n’a entraîné qu’une récupération de 21 à 31 %. L’utilisation d’un capillaire de diamètre intérieur plus grand, conduit à un meilleur flux de vers pendant in vivo FPOP, le capillaire plus petit ne permet pas un flux de vers unique, et de multiples vers sont vus coulant ensemble à la fenêtre rayonnante laser, ce qui diminue la quantité d’exposition au laser par ver. Des chromatogrammes ioniques extraits représentatifs d’un peptide modifié et non modifié FPOP ont montré que le radical hydroxyle modifie la chimie des peptides oxydatifs modifiés, les rendant plus polaires.
Dans la chromatographie de phase inverse, les peptides modifiés in vivo FPOP ont des temps de rétention plus précoces que les peptides non modifiés. La fragmentation de la SP des peptides isolés permet d’identifier les résidus oxydatifs modifiés. In vivo FPOP a modifié de façon oxydative un total de 545 protéines à travers deux répliques biologiques au sein de C-elegans.
Un avantage de cette méthode d’empreinte protéique, est sa capacité à modifier les protéines, dans une variété de systèmes corporels dans les vers. L’analyse tandem de MS confirme in vivo L’accessibilité de solvant de sonde de sonde de FPOP in vivo. Le modèle d’oxydation de la protéine de choc thermique 90 dans le complexe avec la protéine de chaperon de myosin UNC 45, a été analysé et quatre résidus oxydants modifiés, ont été trouvés.
L’utilisation de C-elegans pour in vivo FPOP, offre le potentiel d’étudier le rôle des interactions protéine-protéine et de la structure protéique dans la pathogénie de la maladie.
