在Vivo羟基基蛋白足迹研究卡诺哈布迪特人的蛋白质相互作用

体内FPOP蛋白-蛋白质相互作用和C-elegans的蛋白质结构变化。这些动物被广泛用作研究人类疾病的模型系统。通过将体内FPOP与质谱学耦合，我们可以探测活体动物中不同细胞和体舱内的蛋白质-蛋白质相互作用，而无需隔离一种特定的蛋白质。

通过切割两厘米的氟化乙烯丙烯或 FPP 管，开始流系统组装。使用干净的解剖针来扩大管子一端的内径，形成一个长度约 15 毫米的小陨石坑。要创建流系统的注入线，请切割至 15 厘米的 250 微米内径熔融石英与陶瓷切割机。

将两个毛细管与自粘胶带一起胶带，确保两端 100% 冲洗。将两个毛细管插入 FPP 油管的弹坑中，将它们推到最边缘。将一小点环氧树脂放在干净的表面上，并和解剖针混合。

使用相同的针头快速放置一小滴树脂，在注入毛细管的末尾，在那里它们与 FPP 管连接，让树脂干燥出口侧向上几分钟。同时，切割新的250微米内径毛细管，这将成为流系统的出口毛细管。树脂干燥后，将新的毛细管插入 FPP 管出口端。

出口毛细管的内端和两个注入毛细管应相互冲洗，形成混合茶。如前所述，用新鲜的环氧树脂与毛细管和FPP管粘合，使流动系统在一夜之间干燥。在一个五毫升注射器内插入四个磁力搅拌器，以防止蠕虫在体内快速光化学氧化蛋白质或体内的 FPOP 期间在此注射器中沉淀。

用 M9 填充此和额外的五毫升注射器，确保避免产生气泡。将下部适配器连接到每个注射器，确保它们手指紧固并固定到位。然后，将每个注射器连接到单个三二阀的中间端口。

将每个注射器固定到双注射器泵，并调整机械颜色，以防止来自推杆块的过压。使用超级法兰列表，而不是 FEP 套筒和超级法兰列表变量，将先前制作的微流体系统的每个注入毛细管端连接到每个三两个阀的顶部端口。最后，将一个10厘米450微米的内径毛细管连接到阀门的底部端口，作为提取样品毛细管。

启动泵流量并目视检查所有连接有无泄漏。使用实验流速至少流三个注射器体积。流道由三两个阀手柄上的箭头标记，每个注射器可以通过将阀手柄从排出位置移动到退出位置手动重新填充。

检查微流体流系统后，将微流体流系统移动到实验台，用不锈钢结合将出口毛细管固定到辐射阶段。使用伸长打火机在激光照射窗口燃烧熔融石英涂层，并使用绒组织及甲醇清洁燃烧的涂层。用磁搅拌器将磁搅拌器块放在注射器上方，并调整速度，使搅拌器缓慢而持续地旋转。

打开 Krypton 氟化物兴奋激光器，让甲状腺 tron 预热。通过将光学传感器放置在光束出口窗口，以 50 赫兹的频率测量激光能量，至少 100 个脉冲。在500微升体积中手动提取约1万只蠕虫进入样品注射器。

然后用2.5毫升的M9缓冲液填充，确保避免气泡。样本大小至少为 10，000 个蠕虫非常重要。样本量越小，下游蛋白质分析的蛋白质产量就会低。

将第二个注射器中填上三毫升200毫摩尔过氧化氢。在出口毛细管的末端，放置一个15毫升的圆锥管，其中6毫升为40毫摩尔DMTU，40毫升PBN，1%的时间是苹果酱氧化物。从软件窗口启动兴奋激光器，等待第一个脉冲，然后从双注射器启动样品流。

在 15 毫升管中收集整个样品，同时主动监测样品流量是否有任何视觉泄漏。在体内FPOP后，以805倍g离心对蠕虫进行两分钟的颗粒。吸灭淬火溶液，并添加250微升的许可缓冲液。

将样品转移到干净的微型离心管中，将其闪光冻结并储存在负80摄氏度，直到样品消化。使用具有两个不同内径的毛细血管在体内FPOP后对蠕虫回收进行比较。当使用250微米内径毛细管时，在两个生物复制中实现了63%至89%的总样本回收率。

使用 150 微米内径毛细管只能回收 21 至 31%。使用更大的内径毛细管，导致在体内FPOP期间更好的蠕虫流动，较小的毛细管不允许单蠕虫流动，并且看到多个蠕虫在激光辐射窗口一起流动，从而减少每个蠕虫的激光照射量。代表性提取的FPOP改性、未经改性肽的离子色谱表明，羟基基改变了氧化改性肽的化学成分，使其更具极性。

在反相色谱中，体内FPOP改性肽的保留时间比未改性肽要早。MS分离肽的碎片，允许识别氧化改性残留物。体内FPOP在C-elegans的两个生物复制体中氧化地修改了总共545种蛋白质。

这种蛋白质足迹方法的一个优点是它能够在蠕虫的各种身体系统中修改蛋白质。Tandem MS 分析确认体内 FPOP 探针溶剂在体内的可访问性。分析了热休克蛋白90与米奥辛伴经蛋白UNS45的氧化模式，发现了4种氧化修饰残留物。

使用C-elegans在体内FPOP，提供了研究蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质结构在疾病发病机制中的作用的潜力。