الخلايا أحادية النوى اللوزين هي أكثر أهمية وتعقيدا من خلايا الدم، وعزلها يسمح لدراسة استجابة الخلايا المناعية في الأمراض التي تنطوي على مناعة المخاطية. تسمح التقنية التي أنشأناها باسترداد عدد كبير من الخلايا المناعية من الأنسجة المخاطية مع الحفاظ على سلامتها للدراسات الفيفو السابقة. الأسلوب هو واضح جدا، ولكن اللوزتين تحتاج إلى التعامل معها بسرعة وبعناية من أجل تحقيق أقصى قدر من العائد.
نقل الأنسجة الطنينية البشرية إلى المختبر كما هو موضح في نص المخطوطة. بعد ذلك، ضع مصفاة الخلية على طبق ثقافة 150 في 25 ملليمتر. ضع جميع أدوات التشريح في طبق آخر لإبقائها معقمة.
يجب التعامل مع جميع العينات الرئيسية الخاصة بك بعناية لأنها لم تكن مؤهلة من قبل وقد تحتوي على عوامل معدية. ثم صب برنامج تلفزيوني من القارورة إلى مصفاة، لأنه سوف تحتوي على بعض الخلايا التي قد الخروج اللوزتين. باستخدام ملقط معقمة، نقل اللوزتين من القارورة إلى طبق الثقافة باستخدام ملقط العقيمة.
إذا لزم الأمر ، إضافة المزيد من برنامج تلفزيوني لتزج الشبكة. يستغرق التشريح حوالي 45 دقيقة لكل لوزة. ومن الأهمية بمكان أن تكون لوزات خلال هذا الوقت مغمورة لضمان صلاحية جيدة وغلة الخلية.
إزالة الكي الدموية والليفية الأنسجة باستخدام ملقط ومشرط. باستخدام مشرط وملاقط المنحنية، وقطع الأنسجة إلى قطع صغيرة من أقل من نصف سنتيمتر في القطر. قطع جميع الأنسجة بحيث يمكن أن تكون مغمورة قطع صغيرة في جميع الأوقات.
ضع بعض قطع الأنسجة في مصفاة الخلية. كشط لهم على الشبكة مع آفة الزجاج حتى طبقة رقيقة جدا من السترما الأبيض يبقى. إزالة والتخلص من stroma لتجنب انسداد الشبكة.
ثم استخدام ماصة 10 ملليلتر لنقل تعليق الخلية على الشبكة وكشط مرة أخيرة. بعد ذلك، استخدم ماصة 10 ملليلتر لنقل تعليق الخلية إلى قارورة معقمة. غسل الشبكة ومصفاة الخلية مع برنامج تلفزيوني مرة واحدة، ونقل برنامج تلفزيوني إلى القارورة أيضا.
قبل المضي قدما السماح تعليق الخلية بقية على مقاعد البدلاء لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ضع منخلًا معمّمًا 70 ميكرومترًا فوق قارورة جديدة من 50 ملليلتر. نقل بلطف تعليق الخلية على المنخل مع ماصة 10 ملليلتر.
إذا كان المنخل مسدودًا ، استخدم الجزء الخلفي من طرف ماصة معقمة من ميلي واحد لتكشط الخلايا من خلال المنخل. تغيير منخل كلما لزم الأمر. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 250 مرة ز لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية.
بعد الطرد المركزي، تخلص من المغرور. إعادة تعليق بيليه عن طريق النقر بلطف على القارورة، ومن ثم إعادة تعليق الخلايا في 35 ملليلتر من برنامج تلفزيوني. لإكمال المرحلة الأولى من عزل الخلايا، ضع منخلًا جديدًا سعة 70 ميكرومترًا فوق قارورة جديدة ونقل تعليق الخلية إليها مع ماصة 10 ملليلتر.
للحصول على حل أكثر وضوحاً للخلايا، ابدأ بإضافة 15 ملليلتر من متوسط تدرج الكثافة إلى قارورة جديدة بـ 50 ملليلتر. صب حل TMC على رأس متوسطة التدرج الكثافة، مع الحرص على تقليل الاختلاط. بعد ذلك، الطرد المركزي الحل في 1000 مرات ز لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع تسارع والفرامل قبالة.
بعد إزالة القارورة من جهاز الطرد المركزي، استخدم ماصة 10 ملليلتر لإزالة الطبقة العليا والتخلص منها. لا تزعج الواجهة بين TMCs ومتوسط التدرج الكثافة. ثم قم بإزالة TMCs مع طرف ماصة مليلتر واحد معقمة ونقلها إلى قارورة جديدة 50 ملليلتر.
لغسل الخلايا، أولا إضافة 50 ملليلتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على مصل الأبقار الجنينية 2٪ و 2 ملليمولار EDTA. ثم الطرد المركزي الأنبوب في 250 مرات ز لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. غسل الخلايا مرة أخرى، ولكن هذه المرة الطرد المركزي الأنبوب في 400 مرات ز لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية.
إعداد R10 ثقافة المتوسطة من خلال استكمال RPMI 1640 مع 10٪ FBS المعطلة الحرارة, 2 ملليمولار L-الجلوتامين, والمحلول المضاد الحيوي. إعادة تعليق TMCs في 10 ملليلتر R10. ثم عد الخلايا.
يمكن استخدام الخلايا على الفور أو تجميدها للاستخدام المستقبلي كما هو موضح في المخطوطة. وكانت TMCs ملطخة، المحتضنة بالأجسام المضادة، وتتميز باستخدام عملية استئصال الانسياب. تحتوي TMCs على جميع أنواع الخلايا المناعية الرئيسية الموجودة في الخلايا أحادية النوى الطرفية من الدم، وهي مختصرة PMBC.
ومع ذلك، كانت ترددات جميع أنواع الخلايا، باستثناء الخلايا B، أقل في اللجان عبر الوطنية منها في PBMCs. لدراسة تنشيط الخلايا في إنتاج السيتوكين، تم تحفيز TMCs بين عشية وضحاها مع resiquimod R848. وأنتجت شركات التكريم، المرسومة باللون الأزرق، جميع السيتوكينات التي تم اختبارها باستثناء IFN Lambda 2/3 و IL-8، على الرغم من أن الإنتاج كان أقل مما هو عليه في PBMCs، الذي تم تخطيطه باللون الأخضر.
ويلاحظ أضعاف الزيادات مقارنة التحفيز R848 إلى أي التحفيز في الحمراء. تم تحفيز الكتل المنقية والمعزولة TMCs، الأزرق، وتكتلات الأنسجة اللوزتين، البرتقالي، لمدة 24 ساعة مع فيروس الأنفلونزا A، IAV. تم الكشف عن إنتاج IFN في TMCs ولكن ليس في تراكب كتل الأنسجة مما يشير إلى أن الخلايا اكراميات الأنسجة ليست أفضل نموذج لدراسة إفراز السيتوكين وتنشيط الخلايا.
بعد الحضانة المسبقة مع الدواء السام C1 والتحفيز مع R848 ، تم فحص TMCs و PBMCs لمقومات البقاء. وكانت الشركات عبر الوطنية أكثر حساسية إزاء جيم 1. وهذا يشير إلى أن الأدوية الجديدة في العلاجات المستقبلية يجب أن تختبر في الخلايا من الأنسجة، وليس فقط على خطوط الخلايا، PBMCs، أو explants الأنسجة. هذا الإجراء يسمح لنا لاستخدام TMCs مثل PBMCs من الدم كله وإجراء نفس التجارب الخلوية مثل تنقية نوع خلية معينة، وثقافة الخلية، تدفق cytometry أو تجميد.
إنعاليات TMCs تجعل من الممكن أن تميز بشكل أفضل، في نموذج ذي صلة، الاستجابة المناعية في الأعضاء اللمفاوية الثانوية في الأمراض التي تنطوي على مناعة المخاطية.
