Моноядерные клетки тонзилляра более актуальны и сложны, чем клетки крови, и их изоляция позволяет изучать иммунный клеточный ответ при патологиях, связанных с слизистым иммунитетом. Техника, которую мы установили, позволяет восстановить большое количество иммунных клеток из слизистой ткани, сохраняя при этом их целостность для исследований ex vivo. Метод довольно прост, но миндали должны быть обработаны быстро и с осторожностью, с тем чтобы максимизировать урожайность.
Транспортировка человеческой тонзиллярной ткани в лабораторию, как описано в тексте рукописи. Затем поместите клеточный ситечко на блюдо культуры 150 на 25 миллиметров. Поместите все инструменты для вскрытия в другое блюдо, чтобы держать их стерильными.
Все ваши основные образцы должны быть обработаны с осторожностью, поскольку они ранее не были квалифицированы и могут содержать инфекционные агенты. Затем вылейте PBS из флакона в ситечко, потому что он будет содержать некоторые клетки, которые регрессировали миндали. Используя стерильные типсы, перенесите миндали из флакона в культурную тарелку с помощью стерильных типсов.
При необходимости добавьте больше PBS, чтобы погрузить сетку. Вскрытие займет около 45 минут на миндалин. Крайне важно, чтобы в течение этого времени миндалины погружались в воду, чтобы обеспечить хорошую жизнеспособность и урожайность клеток.
Удалите прижигаемую кровавую и миомную ткань с помощью миппов и скальпеля. Используя скальпель и изогнутые пинцеты, разрежьте ткань на мелкие кусочки диаметром менее половины сантиметра. Вырезать все ткани так, что мелкие кусочки могут быть погружены в любой момент.
Поместите несколько кусков ткани в клеточный ситечко. Очистите их на сетку со стеклянным пестиком, пока не останется только очень тонкий слой белой стромы. Удалите и отбросьте строму, чтобы избежать засорения сетки.
Затем используйте 10-миллилитровую пипету для переноса подвески ячейки на сетку и соскребать ее в последний раз. Затем используйте 10-миллилитровую пипету для переноса клеточной подвески в стерильный флакон. Вымойте сетку и ситечко клетки с PBS один раз, и передать PBS на флакон также.
Перед началом дайте подвеске клетки отдохнуть на скамейке в течение пяти минут при комнатной температуре. Поместите стерильное 70-микрометровое сито поверх нового 50-миллилитрового флакона. Аккуратно перенесите подвесную клетку на сито с 10-миллилитровой пипеткой.
Если сито забито, используйте заднюю часть стерильной одноми миллилитровой наконечник пипетки, чтобы соскребать клетки через сито. Изменение сито так часто, как это необходимо. Центрифуга клетки при 250 раз g в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.
После центрифугации отбросьте супернатант. Повторно приостановить гранулы, осторожно нажав флакон, а затем повторно приостановить клетки в 35 миллилитров PBS. Чтобы завершить первую фазу изоляции клеток, поместите новое 70-микрометровое сито поверх нового флакона и перенесите на него подвеску клетки с помощью 10-миллилитровой пипетки.
Чтобы получить более четкий клеточный раствор, начните с добавления 15 миллилитров градиентной среды плотности к новому 50-миллилитровому флакону. Налейте решение TMC поверх среды градиента плотности, будьте осторожны, чтобы свести к минимуму смешивание. Далее центрифуга раствора при 1000 г в течение 30 минут при комнатной температуре с ускорением и торможением.
После удаления флакона из центрифуги используйте 10-миллилитровую пипету для удаления и отбрасывания верхнего слоя. Не мешать интерфейсу между ТМК и градиентной средой плотности. Затем удалите ТМК стерильным одноми миллилитровым наконечником пипетки и перенесите их в новый 50-миллилитровый флакон.
Для мытья клеток сначала добавьте 50 миллилитров PBS, содержащих 2%фетальную сыворотку крупного рогатого скота и 2 миллимолярные ЭДТА. Затем центрифуга трубки при 250 раз g в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Вымойте клетки снова, но на этот раз центрифуга трубки на 400 раз g в течение 10 минут при четырех градусах по Цельсию.
Подготовка R10 культуры среды, дополнив RPMI 1640 с 10% тепла инактивированных FBS, 2 миллимолялар L-глутамин, и антибиотик раствор. Повторно приостанавливать ТМК в 10 миллилитров R10. Тогда посчитайте клетки.
Клетки могут быть использованы немедленно или заморожены для использования в будущем, как описано в рукописи. ТМК окрашивались, инкубировались антителами и характеризовались цитометрией потока. ТМК содержали все основные типы иммунных клеток, присутствующих в периферических моноядерных клетках крови, сокращенно PMBC.
Однако частоты всех типов клеток, за исключением В-клеток, были ниже в ТМК, чем в ПКМК. Для изучения активации клеток в производстве цитокинов, ТМК стимулировались на ночь с resiquimod R848. ТМК, построенные синим цветом, производили все проверенные цитокины, за исключением IFN Lambda 2/3 и IL-8, хотя производство было ниже, чем в ПМК, построенных зеленым цветом.
Складка увеличивается, сравнивая стимуляцию R848 с отсутствием стимуляции, отмеченной красным цветом. Очищенные и изолированные ТМК, блоки синей и тонзиллярной тканей, оранжевые, стимулировались в течение 24 часов вирусом гриппа А, IAV. Производство IFN было обнаружено в ТМК, но не в супернатанте тканевых блоков, указывающих на то, что экспланты тканей не являются лучшей моделью для изучения секреции цитокинов и активации клеток.
После предварительной инкубации с токсичным препаратом С1 и стимуляции с R848, ТМК и ПКМК были анализированы на жизнеспособность. ТМК были более чувствительны к C1. Это говорит о том, что новые препараты в будущих методов лечения должны быть протестированы в клетках из тканей, а не только на клеточных линиях, ПКМК, или ткани explants. Эта процедура позволяет нам использовать ТМК, такие как ПМК из цельной крови, и проводить те же клеточные эксперименты, такие как очищение определенного типа клеток, культура клеток, цитометрия потока или замораживание.
Изоляция ТМК позволяет лучше охарактеризовать в соответствующей модели иммунный ответ во вторичных лимфоидных органах при патологиях, связанных с слизистым иммунитетом.
