Tonsiller mononukleäre Zellen sind relevanter und komplexer als Blutzellen, und ihre Isolierung ermöglicht die Untersuchung der Immunzellreaktion in Pathologien mit Schleimhautimmunität. Die von uns etablierte Technik ermöglicht die Rückgewinnung einer großen Anzahl von Immunzellen aus einem Schleimhautgewebe und behält gleichzeitig ihre Integrität für Ex-vivo-Studien. Die Methode ist recht einfach, aber die Mandeln müssen schnell und mit Sorgfalt behandelt werden, um den Ertrag zu maximieren.
Transportieren Sie das menschliche Tonsillergewebe ins Labor, wie im Manuskripttext beschrieben. Als nächstes legen Sie das Zellsieb auf eine 150 mal 25 Millimeter große Kulturschale. Legen Sie alle Sezierinstrumente in ein anderes Gericht, um sie steril zu halten.
Alle Ihre Hauptproben sollten mit Vorsicht behandelt werden, da sie noch nicht qualifiziert wurden und Infektionserreger enthalten können. Dann gießen Sie die PBS aus der Durchstechflasche in ein Sieb, weil es einige Zellen enthalten wird, die die Mandeln ausgetreten sind. Mit sterilen Zangen die Mandeln aus der Durchstechflasche mit steriler Zange in die Kulturschale übertragen.
Fügen Sie ggf. weitere PBS hinzu, um das Raster einzutauchen. Die Sezierung dauert etwa 45 Minuten pro Tonnen. Es ist entscheidend, dass während dieser Zeit die Mandeln untergetaucht werden, um eine gute Lebensfähigkeit und Zellerträge zu gewährleisten.
Entfernen Sie kauterisiertes blutiges und fibroides Gewebe mit Zangen und einem Skalpell. Schneiden Sie das Gewebe mit dem Skalpell und der gekrümmten Pinzette in kleine Stücke von weniger als einem halben Zentimeter Durchmesser. Schneiden Sie das gesamte Gewebe, so dass die kleinen Stücke jederzeit eingetaucht werden können.
Legen Sie ein paar Gewebestücke in das Zellsieb. Schrotten Sie sie mit einem Glasschädling auf das Gitter, bis nur noch eine sehr dünne Schicht weißer Stroma übrig bleibt. Entfernen und verwerfen Sie die Stroma, um eine Verstopfung des Rasters zu vermeiden.
Verwenden Sie dann eine 10-Milliliter-Pipette, um die Zellsuspension auf das Gitter zu übertragen und ein letztes Mal zu kratzen. Als nächstes verwenden Sie eine 10-Milliliter-Pipette, um die Zellsuspension in eine sterile Durchstechflasche zu übertragen. Waschen Sie das Gitter und das Zellsieb einmal mit PBS und übertragen Sie die PBS auch auf die Durchstechflasche.
Bevor Sie fortfahren, lassen Sie die Zellaufhängung fünf Minuten bei Raumtemperatur auf der Bank ruhen. Legen Sie ein steriles 70-Mikrometer-Sieb auf eine neue 50-Milliliter-Durchstechflasche. Übertragen Sie die Zellsuspension vorsichtig mit einer 10-Milliliter-Pipette auf das Sieb.
Wenn das Sieb verstopft ist, verwenden Sie die Rückseite einer sterilen Ein-Milliliter-Pipettenspitze, um die Zellen durch das Sieb zu kratzen. Ändern Sie das Sieb so oft wie nötig. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 250 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.
Nach der Zentrifugation den Überstand entsorgen. Setzen Sie das Pellet durch sanftes Tippen auf die Durchstechflasche wieder auf, und setzen Sie die Zellen dann in 35 Milliliter PBS wieder auf. Um die erste Phase der Zellisolierung abzuschließen, legen Sie ein neues 70-Mikrometer-Sieb auf eine neue Durchstechflasche und übertragen Sie die Zellsuspension mit einer 10-Milliliter-Pipette darauf.
Um eine klarere Zelllösung zu erhalten, fügen Sie zunächst 15 Milliliter eines Dichtegradientenmediums zu einer neuen 50-Milliliter-Durchstechflasche hinzu. Gießen Sie die TMC-Lösung auf das Dichtegradientenmedium, wobei Sie darauf achten, das Mischen zu minimieren. Als nächstes zentrifugieren Sie die Lösung bei 1000 mal g für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit Beschleunigung und Abbremsen.
Nachdem Sie die Durchstechflasche aus der Zentrifuge entfernt haben, verwenden Sie eine 10-Milliliter-Pipette, um die obere Schicht zu entfernen und zu verwerfen. Stören Sie nicht die Schnittstelle zwischen den TMCs und dem Dichtegradientenmedium. Entfernen Sie dann die TMCs mit der sterilen Ein-Milliliter-Pipettespitze und geben Sie sie in eine neue 50-Milliliter-Durchstechflasche.
Um die Zellen zu waschen, fügen Sie zuerst 50 Milliliter PBS mit 2% fetalem Rinderserum und 2 Millimolar EDTA hinzu. Dann zentrifugieren Sie das Rohr bei 250 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Waschen Sie die Zellen wieder, aber dieses Mal Zentrifuge das Rohr bei 400 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.
Bereiten Sie R10 Kulturmedium durch Ergänzung RPMI 1640 mit 10% hitzeinaktivierten FBS, 2 Millimolar L-Glutamin, und die Antibiotikum-Lösung. Setzen Sie die TMCs in 10 Milliliter R10 wieder aus. Zählen Sie dann die Zellen.
Die Zellen können entweder sofort oder eingefroren für die zukünftige Verwendung verwendet werden, wie im Manuskript beschrieben. TMCs wurden mit Antikörpern befleckt, inkubiert und mit Durchflusszytometrie charakterisiert. TMCs enthielten alle wichtigen Immunzelltypen, die in peripheren mononukleären Zellen aus Blut, abgekürzt PMBC, vorhanden sind.
Die Frequenzen aller Zelltypen, mit Ausnahme von B-Zellen, waren jedoch in TMCs niedriger als bei PBMCs. Um die Zellaktivierung in der Zytokinproduktion zu untersuchen, wurden TMCs über Nacht mit Resiquimod R848 stimuliert. TMCs, blau geplottet, produzierten alle getesteten Zytokine mit Ausnahme von IFN Lambda 2/3 und IL-8, obwohl die Produktion niedriger war als in PBMCs, grün dargestellt.
Die Falterhöhungen im Vergleich der R848 Stimulation mit keiner Stimulation sind rot notiert. Gereinigte und isolierte TMCs, blaue und tonsillierte Gewebeblöcke, orange, wurden 24 Stunden lang mit dem Influenza-A-Virus IAV stimuliert. Die IFN-Produktion wurde in TMCs nachgewiesen, aber nicht im Überstand der Gewebeblöcke, was darauf hindeutet, dass Gewebeexate nicht das beste Modell für die Untersuchung der Zytokinsekretion und Zellaktivierung sind.
Nach der Vorinkubation mit dem toxischen Medikament C1 und der Stimulation mit R848 wurden TMCs und PBMCs auf Ihre Lebensfähigkeit geprüft. TMCs waren empfindlicher gegenüber C1. Dies legt nahe, dass neue Medikamente in zukünftigen Behandlungen in Zellen aus Geweben getestet werden sollten, nicht nur an Zelllinien, PBMCs oder Gewebeexplantationen. Dieses Verfahren ermöglicht es uns, die TMCs wie PBMCs aus Vollblut zu verwenden und die gleichen zellulären Experimente durchzuführen, wie die Reinigung eines bestimmten Zelltyps, Zellkultur, Durchflusszytometrie oder Einfrieren.
Isolierungen von TMCs ermöglichen es, in einem relevanten Modell die Immunantwort in sekundären Lymphorganen in Pathologien mit Schleimhautimmunität besser zu charakterisieren.
