Les cellules mononucléaires amygdales sont plus pertinentes et complexes que les cellules sanguines, et leur isolement permet l’étude de la réponse des cellules immunitaires dans les pathologies impliquant l’immunité muqueuse. La technique que nous avons établie permet la récupération d’un grand nombre de cellules immunitaires à partir d’un tissu muqueux tout en conservant leur intégrité pour les études ex vivo. La méthode est assez simple, mais les amygdales doivent être manipulées rapidement et avec soin afin de maximiser le rendement.
Transportez le tissu amygdale humain au laboratoire tel que décrit dans le texte manuscrit. Ensuite, placez la passoire cellulaire sur un plat de culture de 150 x 25 millimètres. Placez tous les instruments de dissection dans un autre plat pour les garder stériles.
Tous vos échantillons principaux doivent être manipulés avec soin car ils n’ont pas été préalablement qualifiés et peuvent contenir des agents infectieux. Versez ensuite le PBS du flacon dans une passoire, car il contiendra certaines cellules qui ont égressé les amygdales. À l’aide de forceps stériles, transférer les amygdales du flacon dans le plat de culture à l’aide de forceps stériles.
Si nécessaire, ajouter plus de PBS pour immerger la grille. La dissection prendra environ 45 minutes par amygdale. Il est crucial que pendant ce temps les amygdales soient submergées pour assurer une bonne viabilité et des rendements cellulaires.
Enlever les tissus sanguins et fibromes cautérisés à l’aide de forceps et d’un scalpel. À l’aide du scalpel et de la pince incurvée, couper le tissu en petits morceaux de moins d’un demi-centimètre de diamètre. Couper tous les tissus afin que les petits morceaux puissent être immergés en tout temps.
Placez quelques morceaux de tissu dans la passoire cellulaire. Grattez-les sur la grille avec un pilon en verre jusqu’à ce qu’il ne reste qu’une très fine couche de stroma blanc. Retirer et jeter le stroma pour éviter d’obstruer la grille.
Ensuite, utilisez une pipette de 10 millilitres pour transférer la suspension cellulaire sur la grille et la gratter une dernière fois. Ensuite, utilisez une pipette de 10 millilitres pour transférer la suspension cellulaire dans un flacon stérile. Lavez la grille et la passoire cellulaire avec PBS une fois, et transférez le PBS sur le flacon également.
Avant de procéder, laisser reposer la suspension cellulaire sur le banc pendant cinq minutes à température ambiante. Placez un tamis stérile de 70 micromètres sur un nouveau flacon de 50 millilitres. Transférer délicatement la suspension cellulaire sur le tamis avec une pipette de 10 millilitres.
Si le tamis est obstrué, utilisez le dos d’une pointe stérile de pipette d’un millilitre pour racler les cellules à travers le tamis. Changez le tamis aussi souvent que nécessaire. Centrifuger les cellules à 250 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.
Après centrifugation, jeter le supernatant. Suspendez la pastille en tapant doucement sur le flacon, puis suspendez les cellules en 35 millilitres de PBS. Pour terminer la première phase de l’isolement cellulaire, placez un nouveau tamis de 70 micromètres au-dessus d’un nouveau flacon et transférez la suspension cellulaire sur elle avec une pipette de 10 millilitres.
Pour obtenir une solution cellulaire plus claire, commencez par ajouter 15 millilitres d’un milieu de gradient de densité à un nouveau flacon de 50 millilitres. Verser la solution TMC sur le dessus du milieu de gradient de densité, en prenant soin de minimiser le mélange. Ensuite, centrifugez la solution à 1000 fois g pendant 30 minutes à température ambiante avec accélération et freinez.
Après avoir retiré le flacon de la centrifugeuse, utilisez une pipette de 10 millilitres pour enlever et jeter la couche supérieure. Ne perturbez pas l’interface entre les CMT et le milieu de gradient de densité. Retirez ensuite les CMT avec la pointe stérile de pipette d’un millilitre et transférez-les sur un nouveau flacon de 50 millilitres.
Pour laver les cellules, ajoutez d’abord 50 millilitres de PBS contenant 2% de sérum bovin fœtal et 2 millimolaires EDTA. Puis centrifuger le tube à 250 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Lavez les cellules à nouveau, mais cette fois centrifuger le tube à 400 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.
Préparez le milieu de culture R10 en complétant rpmi 1640 avec 10% FBS inactivé par la chaleur, 2 millimolar L-glutamine, et la solution antibiotique. Suspendre à nouveau les CMT en 10 millilitres de R10. Alors comptez les cellules.
Les cellules peuvent être utilisées immédiatement ou congelées pour une utilisation future comme décrit dans le manuscrit. Les MCC ont été tachés, incubés avec des anticorps, et caractérisés utilisant la cytométrie de flux. Les CMT contenaient tous les principaux types de cellules immunitaires présents dans les cellules mononucléaires périphériques du sang, abrégées PMBC.
Cependant, les fréquences de tous les types de cellules, à l’exception des cellules B, étaient plus faibles dans les MCM que dans les PBMCs. Pour étudier l’activation cellulaire dans la production de cytokine, les CMT ont été stimulés du jour au lendemain avec le resiquimod R848. Les CMT, tracés en bleu, ont produit toutes les cytokines testées à l’exception de l’IFN Lambda 2/3 et de l’IL-8, bien que la production ait été inférieure à celle des PBMC, tracée en vert.
Le pli augmente en comparant la stimulation R848 à aucune stimulation sont notés en rouge. Les CMT purifiés et isolés, les blocs de tissus bleus et amygdales, l’orange, ont été stimulés pendant 24 heures par le virus de la grippe A, l’IAV. La production d’IFN a été détectée dans les CMT, mais pas dans le supernatant des blocs tissulaires indiquant que les explantations tissulaires ne sont pas le meilleur modèle pour l’étude de la sécrétion de cytokine et de l’activation cellulaire.
Après la pré-incubation avec le médicament toxique C1 et la stimulation avec R848, les CMT et les PMC ont été mis à l’essai pour la viabilité. Les CMT étaient plus sensibles à la C1. Ceci suggère que de nouveaux médicaments dans les futurs traitements devraient être examinés dans les cellules des tissus, pas seulement sur des lignes cellulaires, des PBMCs, ou des explants de tissu. Cette procédure nous permet d’utiliser les MCM comme les PBMCs à partir de sangs entiers et d’effectuer les mêmes expériences cellulaires telles que la purification d’un type cellulaire spécifique, la culture cellulaire, la cytométrie du débit ou le gel.
Les isolements des CMT permet de mieux caractériser, dans un modèle pertinent, la réponse immunitaire dans les organes lymphoïdes secondaires dans les pathologies impliquant l’immunité muqueuse.
