يمكن استخدام هذا البروتوكول لإنتاج أفلام الوقت الفاصل من Pseudomonas aeruginosa يحتشدون والتقاط النفور من سرب من bacteriophage أو المضادات الحيوية. أفلام الفاصل الزمني التقاط ديناميات مفصلة من الاستجابة يحتشدون على المضادات الحيوية والجرثومة والتقنية يتطلب فقط مزيل الرطوبة والكمبيوتر والحاضنة ، وماسحة ضوئية الوثائق. لإعداد لوحات أغار يحتشد لP.aeruginosa يحتشدون التصوير الفاصل الزمني، استخدم ماصة 25 ملليلتر لإضافة 20 ملليلتر من محلول أغار المحتشد لكل طبق بيتري التجريبي قطره 10 سنتيمترات.
ضع اللوحات في كومة واحدة مع أغطية لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بدوره على مزيل الرطوبة لتقليل الرطوبة النسبية للغرفة إلى 40-50٪ عندما تتوطد أجار، وتجفيف لوحات أجار يحتشد لمدة 30 دقيقة إضافية في غطاء تدفق لارينار مع الأغطية قبالة ووجه حتى في 300 قدم مكعب في الدقيقة مع رطوبة نسبية 40-50٪ في درجة حرارة الغرفة. ثم تخزين المجففة احتشد لوحات أجار في أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى 24 ساعة.
لاحتشاد أغار الطلاء، عقد طرف ماصة P20 محملة بخمسة microliters من ثقافة P.aeruginosa بين عشية وضحاها في زاوية 10-45 درجة 2-1/2 سم فوق مركز لوحة واحدة يحتشد والاكتئاب المكبس إلى أول وقف لمس أجار مع قطرة السائل فقط. استخدم قالبًا لوضع البقعة باستمرار عبر لوحات agar المختلفة. لوحة عدوى phage، أول مزيج 30 ميكرولتررس من بين عشية وضحاها مثقف P.aeruginosa مع ستة microliters من واحد مرات 10 إلى 12 وحدات تشكيل البلاك لكل ملليلتر من phage DMS3 فير وتضيف على الفور ستة ميكرولترات من خليط P.aeruginosa الفاترة في ستة مواقع الأقمار الصناعية متساوية 2.8 سمين دائرة متحدة المركز كما هو موضح.
استخدم قالبًا لوضع البقعة باستمرار عبر لوحات agar المختلفة. لصفائح العلاج بالمضادات الحيوية، مزيج 30 ميكرولترات من بين عشية وضحاها مثقف P.aeruginosa مع التركيز المناسب وحجم المضادات الحيوية ذات الاهتمام وإضافة على الفور ستة ميكرولترات من البكتيريا المعالجة بالمضادات الحيوية في ستة مواقع الأقمار الصناعية متساوية البعد على دائرة نصف قطرها 2.8 سنتيمتر متحدة المركز حول مركز الطبق. استخدم قالبًا لوضع البقعة باستمرار عبر لوحات agar المختلفة.
عندما تم مطلي جميع الثقافات، استبدل أغطية طبق بيتري الواضحة بأغطية سوداء مصنوعة خصيصًا. ضع بعناية لوحات أجار المحتشدة على ماسح ضوئي في حاضنة 37 درجة مئوية مع حمام مائي 10 لتر للحفاظ على الرطوبة عند 75٪ بعد وضع اللوحات في الماسح الضوئي وفتح الملف وحفظ الإعدادات لتعيين مسار الادخار للصور وانقر على المسح الضوئي و موافق على فترات 30 دقيقة. لأتمتة الحصول على الصورة، استخدم برنامج البرمجة النصية.
حدد كلاً من المسح الضوئي الخمول والمسح الضوئي المفرد وانقر بزر الماوس الأيمن على المسح الضوئي الخمول، ثم انقر بزر الماوس الأيسر على تمكين. في نهاية الحضانة ، استيراد جميع الصور الممسوحة ضوئيا في ImageJ. في إطار خيارات التسلسل، سيشير عدد الصور إلى عدد الصور المحددة.
الحفاظ على بدء الصورة في واحدة لتبدأ من الصورة الأولى في المجلد والصور مقياس في 100 ٪ للحفاظ على الحجم الأصلي للصور. انقر فوق سرية إلى RGB للحفاظ على الصور في اللون. اترك استخدام المكدس الظاهري دون تحديد وانقر فوق موافق لتحميل الصور.
انقر فوق ملف، حفظ باسم و AVI لدمج الصور في ملف AVI. ضبط الضغط إلى JPEG ومعدل الإطارات إلى خمسة إطارات في الثانية. ثم احفظ الفاصل الزمني AVI في مجلد التخزين المناسب.
تصوير الفاصل الزمني لمستعمرة واحدة من نوع البرية P.aeruginosa من لوحة LB agar في مرق LB بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية ورصدت في وسط لوحة أغار يحتشد يكشف عن نمو أولي في شكل مستعمرة في وسط لوحة التي تنتشر في tendrils شعاعي من المستعمرة. تنتقل الأسراب من مركز صحون الأجار المحتشدة إلى المحيط الخارجي ويتم صدها من خلال إشارة الإجهاد المنبعثة من البكتيريا التي كانت مصابة بالفاغات أو عولجت بـ Gentamycin. لا يسبب Phages أو Gentamycin رصدت وحدها في مواقع الأقمار الصناعية السكان يحتشدون لتجنب هذه المناطق.
استخدام ماصة 25 ملليلتر لضمان أن لوحات أجار يحتشدون تحتوي على 20 ملليلتر بالضبط. من المهم أيضا لضبط الوقت تجفيف لوحة وفقا للبيئة المختبرية. تقنية لدينا تمكننا من تصور أنماط حشد العام من السكان pseudomonas aeruginosa.
والهدف التالي هو رصد حركة الخلية الفردية باستخدام المجهر برايتفيلد.
