이 프로토콜은 슈도모나스 아에루기노사 떼의 타임랩스 영화를 생산하고 박테리오파지 또는 항생제에 의한 군단의 반발을 포착하는 데 사용할 수 있습니다. 타임랩스 영화는 항생제와 박테리오파지에 대한 무리반응의 상세한 역학을 포착하고 이 기술은 제습기, 컴퓨터, 인큐베이터 및 문서 스캐너만 필요로 합니다. P.aeruginosa 무리 시간 경과 이미징에 대 한 무리 한천 접시를 준비 하려면, 사용 하 여 25 밀리 리터 파이펫 각 실험 10 센티미터 직경 페트리 접시에 무리 한 천용액의 20 밀리리터를 추가.
플레이트를 실온에서 1시간 동안 뚜껑이 있는 단일 스택에 놓습니다. 제습기를 켜서 방의 상대 습도를 40-50%로 줄이면 한천이 고화되면, 뚜껑이 꺼진 라미나르 플로우 후드에서 30분 동안 떼지어 온통 천판을 건조하고 실내 온도에서 40-50%의 상대 습도로 분당 300입방피트에서 얼굴을 맞춥니다. 그런 다음 말린 천접시를 섭씨 4도에 최대 24시간 동안 보관합니다.
무리한 화나 도금의 경우, 하룻밤 P.aeruginosa 문화에서 5 마이크로리터가 로드된 P20 파이펫 팁을 한 번의 스로밍 플레이트 의 중심 위로 2-1/2 센티미터 의 10-45도 각도로 적재하고 플런저를 액체 방울만 으로 한 채에 닿는 첫 번째 정류장으로 플런저를 누를 피하십시오. 템플릿을 사용하여 다른 무리의 천접시에 걸쳐 위치를 일관되게 배치합니다. 파지 감염을 플레이트하기 위해, 먼저 파지 DMS3 vir의 밀리리터 당 12 개의 플라크 형성 단위에 10 의 6 개의 마이크로 리터와 하룻밤 배양 P.aeruginosa의 30 마이크로 리터를 혼합하고 즉시 2.8 센트의 등평성 위성 위치에 P.aeruginosa 파지 혼합물의 6 마이크로 리터를 추가합니다.
템플릿을 사용하여 다른 무리의 천접시에 걸쳐 위치를 일관되게 배치합니다. 항생제 치료를 플레이트하려면, 하룻밤 배양 P.aeruginosa의 30 마이크로 리터를 관심있는 항생제의 적절한 농도 및 부피와 혼합하고 즉시 접시의 중심에 대한 2.8 센티미터 반경 동심원에 6 개의 등가성 위성 위치에 항생제 처리 된 박테리아의 6 마이크로 리터를 추가합니다. 템플릿을 사용하여 다른 무리의 천접시에 걸쳐 위치를 일관되게 배치합니다.
모든 문화권이 도금되면 클리어 페트리 접시 뚜껑을 맞춤 제작된 블랙 뚜껑으로 교체하십시오. 스캐너에 플레이트를 놓은 후 75%의 습도를 유지하기 위해 섭씨 37도에 설정된 인큐베이터에 스캐너에 무리한 한천 판을 조심스럽게 배치하여 75%의 습도를 유지한 후, 파일을 열고 설정을 저장하여 이미지에 대한 저장 경로를 설정하고 30분 간격으로 스캔 및 확인을 클릭합니다. 이미지 수집을 자동화하려면 스크립팅 소프트웨어를 사용합니다.
유휴 스캔과 단일 스캔을 모두 선택하고 유휴 스캔을 마우스 오른쪽 단추로 클릭한 다음 활성화된 클릭을 클릭합니다. 인큐베이션이 끝나면 스캔한 모든 이미지를 ImageJ로 가져옵니다. 시퀀스 옵션 창에서 이미지 수는 선택한 이미지 수를 나타냅니다.
이미지의 원래 크기를 절약하기 위해 폴더의 첫 번째 그림과 배율 이미지를 100%로 시작하여 이미지를 계속 시작합니다. 이미지를 색상으로 유지하려면 RGB에 은밀한 이미지를 클릭합니다. 가상 스택을 선택 취소 하고 확인을 클릭하여 이미지를 로드합니다.
파일을 클릭하고 AVI로 저장하여 이미지를 AVI 파일로 병합합니다. 압축을 JPEG로 조정하고 프레임 속도를 초당 5프레임으로 조정합니다. 그런 다음 AVI 시간 경과를 적절한 저장소 폴더에 저장합니다.
LB 국물에 있는 LB 한 천판에서 하룻밤 사이에 37도의 야생식 P.aeruginosa의 단일 식민지의 시간 경과 이미징은 식민지에서 빛나는 텐드릴에 퍼지는 접시의 중심에 있는 식민지의 형태로 초기 성장을 보여줍니다. 군단은 무리 한천 판의 중심에서 주변으로 이동하고 파지에 감염되거나 겐타마이신으로 치료된 박테리아에 의해 방출되는 스트레스 신호에 의해 격퇴됩니다. 위성 위치에서 홀로 발견된 파지 나 겐타마이신은 이 지역을 피하기 위해 인구 떼를 일으키지 않습니다.
25 밀리리터 파이펫을 사용하여 무리의 한천 플레이트에 정확히 20밀리리터가 포함되어 있는지 확인합니다. 실험실 환경에 따라 플레이트 건조 시간을 조정하는 것도 중요합니다. 우리의 기술은 우리가 슈도모나스 아루기노사 인구의 전반적인 무리 패턴을 시각화 할 수 있습니다.
다음 목표는 브라이트필드 현미경 검사를 사용하여 개별 세포 운동성을 모니터링하는 것입니다.
