Этот протокол может быть использован для производства замедленной фильмы Pseudomonas aeruginosa роятся и захватить отталкивание роя бактериофагом или антибиотиками. Фильмы замедленного действия фиксируют детальную динамику кишащих ответ на антибиотики и бактериофаг, а техника требует только обезвоживания, компьютера, инкубатора и сканера документов. Для подготовки роятся агар пластины для P.aeruginosa роятся промежуток времени изображения, используйте 25 миллилитров пипетки, чтобы добавить 20 миллилитров роятся агар решение каждого экспериментального 10 сантиметров диаметром Петри блюдо.
Поместите пластины в один стек с крышками в течение одного часа при комнатной температуре. Включите обезвоживание, чтобы уменьшить относительную влажность в помещении до 40-50%Когда агар затвердеет, высушите роятся агар пластины в течение дополнительных 30 минут в ламинарном капюшоне потока с крышками и лицом вверх на 300 кубических футов в минуту с 40-50% относительной влажности при комнатной температуре. Затем храните высушенные роятся агар пластины при четырех градусах по Цельсию на срок до 24 часов.
Для роятся агар покрытие, провести P20 пипетки отзыв загружен с пятью микролитров от ночи P.aeruginosa культуры на 10-45 градусов угол 2-1/2 сантиметров выше центра одной роятся пластины и угнетать поршень до первой остановки касаясь агара только с жидким падением. Используйте шаблон, чтобы располагать пятно последовательно через различные роятся агар пластин. Чтобы пластины фаг инфекции, сначала смешать 30 микролитров ночь культурных P.aeruginosa с шестью микролитров один раз от 10 до 12 бляшек формирования единиц на миллилитр фага DMS3 vir и сразу же добавить шесть микролитров P.aeruginosa фаговой смеси на шесть равномерных спутниковых позиций на 2,8 сантиметра радиус концентрического круга, как попродемонстрировано.
Используйте шаблон, чтобы располагать пятно последовательно через различные роятся агар пластин. Чтобы пластины лечения антибиотиками, смешать 30 микролитров ночь культурных P.aeruginosa с соответствующей концентрацией и объемом антибиотика интерес и сразу же добавить шесть микролитров антибиотиков обработанных бактерий на шесть равномерных спутниковых позиций на 2,8 сантиметра радиус концентрического круга о центре блюда. Используйте шаблон, чтобы располагать пятно последовательно через различные роятся агар пластин.
Когда все культуры были покроеные, заменить четкие крышки чашки Петри с заказными черными крышками. Тщательно поместите роятся агар пластины на сканер в инкубаторе установлен на 37 градусов по Цельсию с 10 литровой водяной бане для поддержания влажности на 75%После размещения пластин в сканер, открыть файл и сохранить настройки, чтобы установить путь экономии для изображений и нажмите сканирования и OK с 30-минутными интервалами. Чтобы автоматизировать получение изображения, используйте программное обеспечение для сценариев.
Выберите как простое сканирование, так и одно сканирование и правое нажатие на простое сканирование, а затем левое нажатие на включенное. В конце инкубации импортируют все отсканированные изображения в ImageJ. В окне вариантов последовательности количество изображений указывает количество выбранных изображений.
Продолжайте начинать изображение на одном, чтобы начать с первого изображения в папке и масштаб изображения на 100%, чтобы сохранить первоначальный размер изображений. Нажмите скрытый RGB, чтобы сохранить изображения в цвете. Оставьте использовать виртуальный стек беспрепятственно и нажмите OK для загрузки изображений.
Нажмите файл, сохраните как и AVI, чтобы объединить изображения в файл AVI. Отрегулируйте сжатие до JPEG и частоту кадров до пяти кадров в секунду. Затем сохраните промежуток времени AVI в соответствующей папке хранения.
Промежуток времени изображения одной колонии дикого типа P.aeruginosa из пластины LB агар в бульоне LB ночь на 37 градусов по Цельсию и заметили в центре роятся агар пластины показывает первоначальный рост в виде колонии в центре пластины, которая распространяется в усики радиально из колонии. Рои перемещаются от центра роятся агар пластины на периферию и отталкиваются от сигнала стресса, испускаемого бактериями, которые были инфицированы фагами или лечение гентамицином. Фаге или гентамыцин, замеченные в одиночку на спутниковых позициях, не вызывают кишащих популяций, чтобы избежать этих областей.
Используйте 25 миллилитров пипетки для обеспечения того, чтобы роятся агар пластины содержат ровно 20 миллилитров. Важно также настроить время сушки пластин в соответствии с лабораторной средой. Наша методика позволяет нам визуализировать общие кишащих моделей популяций Pseudomonas aeruginosa.
Следующая цель состоит в том, чтобы контролировать индивидуальную подвижность клеток с помощью микроскопии Брайтфилда.
