الغرض العام من هذه الطريقة هو تحليل تأثير علاج الإجهاد على الخلايا البكتيرية ، سواء في الخلية الواحدة وعلى مستوى السكان. وهو يوفر رؤية عالمية لتأثير الإجهاد على عدة جوانب من نمو البكتيريا، بما في ذلك جدوى الخلية، مورفولوجيا، ومحتوى الحمض النووي. كما أنه يسمح بتميز الانتعاش السكاني.
ويمكن استخدام هذه الطريقة في صناعة الأدوية لفحص نشاط جزيء مضادات الميكروبات الجديدة وتقدير تأثيرها على بقاء البكتيريا ونموها. العلاج الذي يُحفز الإجهاد له عدم كفاءة، مثل الجرعة والاعتماد على الوقت. قد يكون من الضروري إجراء اختبارات أولية لتحديد الجرعة المثلى ومدة العلاج قبل بدء هذا البروتوكول.
يسمح العرض التوضيحي المرئي لهذا الأسلوب بتصور تفاصيل هامة لكل خطوة مهمة وكيفية تنفيذها بشكل صحيح. لتبدأ, تلقيح خمسة ملليلترات من EZ EZ الغنية المحددة المتوسطة مع مستعمرة واحدة من E.Coli MG1655 HU-PAmCherry وتنمو في 37 درجة مئوية مع اهتزاز في 140 دوران في الدقيقة الواحدة. في صباح اليوم التالي، استخراج 100 ميكرولترات من العينة وتمييعه مع 900 ميكرولترات من المتوسط لقياس الكثافة البصرية في 600 نانومتر.
ثم، تمييع الثقافة في أنبوب اختبار يحتوي على وسيط جديد إلى نانومتر OD600 من 0.01. احتضان أنبوب الاختبار تلقيح في 37 درجة مئوية مع اهتزاز في 140 دورة في الدقيقة حتى تصل الكثافة البصرية 0.2، الموافق للمرحلة الأسية الكاملة في المتوسطة الغنية. ثم، aliquot عينات الثقافة للتصوير المجهري الفاصل الزمني، وتمييع والطلاء المقايسة، وتحليل تدفق القياسات الضوئية، والتصوير لقطة المجهر.
تعريض 4.4 ملليلتر المتبقية من ثقافة الخلية في أنبوب الاختبار لعلاج الإجهاد محددة. على سبيل المثال، 4.4 ميكرولتر من سيفاليكسين في خمسة ميكروغرام لكل ملليلتر واحتضان في 37 درجة مئوية مع اهتزاز في 140 دورة في الدقيقة. إعداد عشرة أضعاف التخفيفات التسلسلية، تصل إلى 10 إلى ناقص السابع، من 200 ميكرولترات عينة الثقافة في المتوسطة الطازجة.
مزيج بين كل تخفيف من قبل دوامة لطيف جدا أو عن طريق عكس الأنبوب. لوحة 100 ميكرولترات من التخفيف المناسب على لوحات غير مختارة LB agarose واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. في اليوم التالي، عد عدد المستعمرات لتحديد تركيز الخلايا القابلة للحياة في كل عينة من الثقافات.
رسم CFU لكل ملليلتر كدالة للوقت لثقافات الخلايا غير المعالجة والمعالجة. قياس OD600 من الثقافة على مقياس الطيف. تمييع عينة الثقافة مع المتوسطة الطازجة في أربع درجات مئوية للحصول على عينة مع OD600 في 0.06، الموافق لحوالي 15،000 خلية لكل ميكرولتر.
بالنسبة لتلطيخ الحمض النووي، اخلط العينة البكتيرية المخففة مع محلول 10 ميكروغرام لكل ملليلتر من صبغة الفلورسنت للحمض النووي في حصة الحجم من واحد إلى واحد واحتضان في الظلام لمدة 15 دقيقة. قبل حقن العينة، اخلط العينة عن طريق دوامة لطيفة جدا أو عن طريق عكس الأنبوب. تمرير العينة في تدفق مقياس الخلايا بمعدل تدفق حوالي 120،000 الخلايا في الدقيقة الواحدة.
الحصول على الضوء إلى الأمام المتناثرة والجانبية المتناثرة وكذلك الحمض النووي صبغة الفلورسنت / إشارة الفلورسنت مع الإعدادات المناسبة. رسم الرسم البياني كثافة الخلية المتناثرة إلى الأمام لتمثيل توزيع حجم الخلية ومؤامرة الحمض النووي الفلورية صبغ / الفلورسنت إشارة كثافة الخلية الرسم البياني لتمثيل محتوى الحمض النووي في الخلية. أولاً، سخني غرفة المجهر الحرارية عند 37 درجة مئوية لتثبيت درجة الحرارة.
إعداد الشرائح التي تحملها agarose كما هو موضح في المخطوطة. ضع الشريحة على مرحلة المجهر وافعل الحصول على الصورة باستخدام الضوء المنقول مع هدف تباين الوجه ومع الإثارة مصدر الضوء في 560 نانومتر ل mCherry. حدد حقول العرض التي تحتوي على خلايا معزولة لتسهيل الكشف التلقائي عن الخلايا أثناء تحليل الصور.
تأكد من أن يتم تصوير ما لا يقل عن 300 خلية للسماح بإجراء تحليل إحصائي قوي لجموع الخلايا. أولا، إزالة حل الحفظ من لوحة microfluidic واستبدالها المتوسطة الطازجة محمّاة مسبقا إلى 37 درجة مئوية كما هو موضح في دليل مستخدم البرمجيات Microfluidic. إرفاق لوحة microfluidic إلى النظام المتعدد.
وفي البرمجيات microfluidic، انقر على زر ختم لختم على لوحة لنظام متعددة. بعد ذلك، انقر على زر فتيلة. ضع لوحة microfluidic مع النظام المتعدد على مرحلة المجهر ويسخني في 37 درجة مئوية لمدة ساعتين لتجنب تمدد الغرفة microfluidic.
إغلاق لوحة microfluidic على نظام microfluidic عن طريق النقر على زر الختم إيقاف. استبدال المتوسطة من بئر ثمانية مع 150 ميكرولترات عينة الثقافة واستبدال المتوسطة من بئر واحد إلى خمسة مع المتوسطة المطلوبة، مع أو بدون كاشف محفز للإجهاد. ختم لوحة microfluidic ووضعها على مرحلة المجهر.
في برنامج microfluidic، قم بتشغيل إجراء تحميل الخلايا. تأكد من أن تحميل الخلايا مرضي من خلال النظر تحت المجهر في الضوء المنقول. التركيز بعناية في وضع الضوء المنقولة واختيار عدة مجالات الرؤية التي تظهر البكتيريا المعزولة وغير مكتظة، حوالي 10 إلى 20 خلية لكل 100 ميكرولتر مربع.
في البرمجيات microfluidic، انقر على زر تشغيل تسلسل مخصص، ثم برنامج حقن المتوسطة المحفزة للإجهاد خلال 10 دقائق في اثنين من PSI، تليها حقن في واحدة PSI لمدة المطلوبين من العلاج الإجهاد. قم بإجراء تصوير المجهر في وضع الفاصل الزمني بإطار واحد كل 10 دقائق، باستخدام تباين الطور في الضوء المنقول ومصدر ضوء 560 نانومتر للإشارة mCherry إذا لزم الأمر. بدء عملية الحصول على صورة مجهرية وبروتوكول الحقن microfluidic في نفس الوقت.
افتح برنامج فيجي والمكون المساعد MicrobeJ. لتحليل اللقطة، قم بإسقاط جميع الصور المطابقة لشريحة مجهر واحدة في شريط التحميل MicrobeJ لسلسة الصور وحفظ ملف رصات الصور التي تم الحصول عليها. بالنسبة لبيانات الفاصل الزمني، ما عليك سوى إسقاط كومة الصور في شريط التحميل الخاص بـ MicrobeJ.
تشغيل الكشف الآلي من الخطوط العريضة للخلية على أساس تجزئة صورة النقيض المرحلة وتشغيل الكشف عن النوى على أساس تجزئة إشارة الفلورسنت الحمض النووي الملون. تحقق من دقة الكشف عن الخلايا بصريا واستخدام أداة تحرير MicrobeJ لتصحيح إذا لزم الأمر. حفظ ملف النتائج التي تم الحصول عليها.
انقر على أيقونة ResultJ لإكمال التحليل والحصول على نافذة ResultJ. يتم إنشاء العديد من أنواع مختلفة من الرسوم البيانية الإخراج. رسم المدرجات التكرارية تطبيع شكل الخلية أو طول ويعني nucleoid عدد في الخلية.
حللت هذه الدراسة سلوك الخلايا الإشريكية الإشريكية K-12 خلال التعرض العابر للسيفالكسين، وهو مضاد حيوي يمنع على وجه التحديد انقسام الخلايا. الثقافات الخلية المتنامية في وجود cephalexin عرضت زيادات OD600 مماثلة كما الثقافات غير مجهدة. لم يزيد تركيز الخلايا القابلة للحياة عندما كان السيفالكسين موجودًا.
بدأت الخلايا في الانقسام مرة أخرى عندما تمت إزالة السيفالكسين ووصلت في نهاية المطاف إلى تركيز يعادل ثقافة غير مجهدة بعد ساعتين. وأسفرت الضغوط المختلفة عن فك مختلف منحنيات OD وCFU لكل ملليلتر، حسب التأثير المستحث. أثار التعرض للcephalexin زيادة موازية من حجم الخلية ومحتوى الحمض النووي.
عندما تمت إزالة السيفليكسين، انخفض حجم الخلية السكانية ومحتوى الحمض النووي تدريجيا وأصبح مشابها للسكان غير المجهدين بعد ساعتين. أثار سيفالكسين تشكيل خلايا طويلة مع عرض الخلايا الطبيعية ثم لا تقسيم سيبتا. وأكد التحليل الكمي للصورة حجم الخلية وزيادة محتوى الحمض النووي.
تؤكد صور الفاصل الزمني أن استطالة الخلية وتكرار الكروموسوم والفصل لم يتم تثبيطهما بسبب التعرض للسيفالكسين. أظهر تحليل نسب الخلايا الخيطية أن انقسام الخلايا أعاد تشغيل ما يقرب من 20 دقيقة بعد غسل الدواء. من المهم للغاية التأكد من أن السكان البكتيريين في نمو أسي كامل قبل تحفيز علاجات الإجهاد.
يمكن أن يكون العلاج المحفز للإجهاد المستخدم لهذه النهج خطرًا على المركبات التجريبية مثل السمية الجينية. حتى التعامل مع مجمع بعناية وارتداء قفاز، قناع، goggle، ومعطف المختبر.
