Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Zeitrafferfilme von Pseudomonas aeruginosa Schwärmen zu produzieren und die Abstoßung von Schwarm durch Bakteriophage oder Antibiotika zu erfassen. Die Zeitrafferfilme erfassen die detaillierte Dynamik der Schwärmereaktion auf Antibiotika und Bakteriophagen und die Technik erfordert nur einen Luftentfeuchter, Computer, Inkubator und Dokumentenscanner. Um Schwärme-Agar-Platten für p.aeruginosa Schwärmezeitraffer-Bildgebung vorzubereiten, verwenden Sie eine 25-Milliliter-Pipette, um jeder experimentellen Petrischale mit 10 ZentimeterDurchmesser 20 Milliliter Schwarmagarlösung hinzuzufügen.
Legen Sie die Platten in einem einzigen Stapel mit Deckeln für eine Stunde bei Raumtemperatur. Schalten Sie einen Luftentfeuchter ein, um die relative Luftfeuchtigkeit des Raumes auf 40-50% zu verringern Wenn der Agar erstarrt ist, trocknen Sie die schwärmenden Agarplatten für weitere 30 Minuten in einer laminaren Durchflusshaube mit den Deckeln aus und stellen Sie sich bei 300 Kubikfuß pro Minute mit einer 40-50% relativen Luftfeuchtigkeit bei Raumtemperatur. Dann die getrockneten Schwarm-Agar-Teller bei vier Grad Celsius bis zu 24 Stunden lagern.
Zum Schwärmen von Agar-Beschichtung eine P20-Pipettespitze, beladen mit fünf Mikrolitern aus einer über Nacht P.aeruginosa Kultur, in einem 10-45-Grad-Winkel 2-1/2 Zentimeter über der Mitte einer Schwarmplatte und drücken Sie den Kolben bis zum ersten Stopp, um den Agar mit nur dem Flüssigkeitstropfen zu berühren. Verwenden Sie eine Vorlage, um den Spot konsistent über die verschiedenen Schwarm-Agarplatten zu positionieren. Um eine Phageninfektion zu melden, mischen Sie zunächst 30 Mikroliter p.aeruginosa mit sechs Mikrolitern von einem mal 10 zu den 12 Plaque-bildenden Einheiten pro Milliliter Phagen DMS3 vir und fügen Sie sofort sechs Mikroliter des P.aeruginosa P.aeruginosa-Phagengemischs an sechs äquidistanten Satellitenpositionen auf einem 2,8 Zentimeter Radius konzentrischen Kreis hinzu, wie gezeigt.
Verwenden Sie eine Vorlage, um den Spot konsistent über verschiedene Schwarm-Agarplatten zu positionieren. Um Antibiotika-Behandlungen zu verankern, mischen Sie 30 Mikroliter von über Nacht kultivierten P.aeruginosa mit der entsprechenden Konzentration und Volumen des Antibiotikums von Interesse und fügen Sie sofort sechs Mikroliter der antibiotikabehandelten Bakterien an sechs äquidistanten Satellitenpositionen auf einem 2,8 Zentimeter Radius konzentrischen Kreis um die Mitte der Schale hinzu. Verwenden Sie eine Vorlage, um den Spot konsistent über die verschiedenen Schwarm-Agarplatten zu positionieren.
Wenn alle Kulturen plattiert sind, ersetzen Sie die klaren Petrischalendeckel durch maßgefertigte schwarze Deckel. Legen Sie die schwärmenden Agarplatten vorsichtig auf einen Scanner in einem Inkubator, der auf 37 Grad Celsius eingestellt ist, mit einem 10-Liter-Wasserbad, um die Luftfeuchtigkeit bei 75% zu halten Nachdem Sie die Platten in den Scanner gelegt haben, öffnen Sie die Datei und speichern Sie die Einstellungen, um den Speicherpfad für die Bilder einzustellen und im 30-Minuten-Takt auf Scannen und OK zu klicken. Um die Bildaufnahme zu automatisieren, verwenden Sie die Skriptsoftware.
Wählen Sie sowohl Leerlauf-Scannen als auch Einzelscan und Rechtsklick auf den Leerlauf-Scan, und klicken Sie dann mit der linken Maustaste auf aktiviert. Importieren Sie am Ende der Inkubation alle gescannten Bilder in ImageJ. Im Fenster Sequenzoptionen gibt die Anzahl der Bilder die Anzahl der ausgewählten Bilder an.
Starten Sie das Bild an einem, um mit dem ersten Bild im Ordner und den Maßstabsbildern bei 100 % zu beginnen, um die ursprüngliche Größe der Bilder zu erhalten. Klicken Sie auf verdeckt auf RGB, um die Bilder in Farbe zu halten. Lassen Sie den virtuellen Stapel deaktiviert und klicken Sie auf OK, um die Bilder zu laden.
Klicken Sie auf Datei, speichern Sie als und AVI, um die Bilder in einer AVI-Datei zusammenzuführen. Passen Sie die Komprimierung auf JPEG und die Bildrate auf fünf Bilder pro Sekunde an. Speichern Sie dann den AVI-Zeitraffer im entsprechenden Speicherordner.
Die Zeitraffer-Bildgebung einer einzigen Kolonie von Wild-Typ P.aeruginosa von einer LB-Agarplatte in LB-Brühe über Nacht bei 37 Grad Celsius und in der Mitte einer schwärmenden Agarplatte gesichtet zeigt ein erstes Wachstum in Form einer Kolonie in der Mitte der Platte, die sich in Ranken radial aus der Kolonie ausbreitet. Schwärme bewegen sich von der Mitte der schwärmenden Agarplatten in die Peripherie und werden durch ein Stresssignal abgewehrt, das von den Bakterien emittiert wird, die mit Phagen infiziert oder mit Gentamycin behandelt wurden. Phages oder Gentamycin, die allein an den Satellitenpositionen gesichtet werden, führen nicht dazu, dass Schwärmepopulationen diese Gebiete meiden.
Verwenden Sie eine 25-Milliliter-Pipette, um sicherzustellen, dass die schwärmenden Agarplatten genau 20 Milliliter enthalten. Es ist auch wichtig, die Plattentrocknungszeit an die Laborumgebung anzupassen. Unsere Technik ermöglicht es uns, die allgemeinen Schwarmmuster von Pseudomonas aeruginosa Populationen zu visualisieren.
Das nächste Ziel ist die Überwachung der individuellen Zellmotilität mit Brightfield-Mikroskopie.
