プログラムされた幹細胞に由来する腎臓臓器培養およびオルガネラは、腎臓の発達と病気の背後にあるメカニズムを研究する優れた方法を提供します。しかし、現在の臓器培養システムは腎臓への血流を提供しない。このため、現在のモデルが不完全であり、血液濾過である腎臓の主な機能を再現できない理由。
本論文では、鶏の胚の絨毛膜上での胚腎臓およびオルガノイドの培養と可視化のための改善されたプロトコルを紹介する。私たちの新しい実験セットアップでは、CAMに移植された腎臓の初歩を、培養培地で満たされた透過性の意味の貯水池に重ね合わせています。このプロトコルは、腎臓の初歩および内皮細胞の生存を著しく増加させる。
この方法は、発達中の糸球体への血流を可能にする。最近では、高分解能共焦点3Dタイムラプスイメージングを提供する新規固定定方向臓器培養法も発表しました。この方法は、オルガノイドおよび臓器の初歩の長期的な共焦点イメージングに最適な条件を提供した。
このアプローチでは、ガラスカバースリップと透過膜の間の組織を穏やかに圧縮します。ここでは、カスタムデザインプレートの作り方と、培養実験の設定方法を示します。従って本書では改良された腎小器官チューブ培養技術を紹介する。
この方法は、小器官の起源をモデル化し、胚性腎臓および腎オルガノイドex vivoを研究するための高解像度イメージングを行うより良い方法を提供する。あなたの実験に応じて、6ウェルまたは12ウェルプレート用に設計されたセルコントラインサートを転送してください。Dremelツールを使用してインサートの側面を切り取り、透過性膜が取り付けられた2ミリメートルの高いプラスチックリングを作成します。
メスや鋭利なナイフでスワーフからリングの端を磨きます。ミニリザーバを70%エタノールで少なくとも1時間殺菌します。その後、蒸留水でオートクレーブでミニ貯水池を洗浄し、ラミナーフードでそれらを乾燥させます。
PBSおよび培養培地でミニリザーバをすすいでください。膜を上向きにした培養培地の滴の上にシャーレの上に貯水池を置きます。解剖された外生体胚性腎臓または腎オルガノイドを膜に配置する。
サンプルの周りに多くの液体を残すことを避け、細胞培養インキュベーターに2〜24時間取り付けたままにしておきます。exenal移植は、8日前の元オボ胚性鶏の絨毛膜に行われる。膜が移植片を覆っているようにミニ貯留層を移す。
彼らは胚をカバーしないようにCAMの周辺にそれらを置きます。次に、ミニリザーバに培養培地を加えます。最大9日間チキンCAMのサンプルを栽培します。
ミニリザーバの培養培地を毎日交換してください。サンプルの血管化は、移植後24〜48時間既に観察され得る。固定培養のためのカスタム設計された6ウェルプレートを作るために。
適切なドリルビットを備えたドリルマシンを使用して、プレートの底部に20ミリメートルの穴を開けて作業を開始する必要があります。次に、プレートの上側にある穴の縁を磨きます。最後に、プレートを70%エタノールで少なくとも1時間殺菌します。
その後、蒸留水でオートクレーブでプレートを洗浄し、レミアフードで乾燥させます。22x22ミリメートルのカバースリップを70%エタノールで洗浄し、完全に乾燥させます。ティッシュ接着剤を使用して、井戸の底の穴の上にカバースリップを接着します。
乾燥後、滅菌顕微鏡でプレートを検査し、余分な接着剤を除去します。まず、ポリスチレンビーズのアリコートを同量の水素と混ぜ合わせます。トランスフィルインサートを、膜を上に向けた解剖顕微鏡の下に置き、腎臓を膜に並べる。
腎臓の次にハイドロジェルビーズ混合物を慎重に追加します。膜と腎臓が下向きになるように、トランスフィルインサートを反転させます。その後、慎重にカスタム設計された6ウェルプレートの私たちの井戸に挿入物を配置します。
インサートを非常に穏やかに井戸に押し込みます。腎臓がビーズのレベルになるまで、顕微鏡からの平坦化の程度に従ってください。挿入物を片手でウェルに少し押し付け、はんだ付けアイロンでインサートの周囲の3点でプラスチックを溶かしてプレートに固定します。
側の開口部を通してウェルに2ミリリットルの培養培地を加えます。タイムラプスイメージングを開始する場合は、プレートを反転顕微鏡のステージインキュベーターに移します。当社の改変CAMキャプチャプロトコルは、腎オルガノイドおよび胚性腎臓の高効率な血管形成を可能にします。
培養培地を含む多くの貯蔵所は、ドナー組織を供給し、血管を進む初期の期間中に乾燥から保護する。この映画は、鶏CAMに移植され、7日間培養された胚性マウス腎臓センターにおける鶏の血液細胞の流れを示しています。この図パネルは、当社の改善されたCAM培養法が腎由来の内皮細胞に対する寛容な条件を提供することを示す。
図AおよびBは、培養日に5日間増殖した胚性腎臓を示し、5日間ニワトリCAMに中心移植した。マウス特異的CD-31抗体による染色は、CAMに移植された腎臓センターの内皮細胞ネットワークが左側のコントロールよりも広範であることを示している。図Cでは、マウスの血管がマウス特異的CD-31抗体で染色され、それが鶏の血管で最も多いことがわかります。
図DとEは、旅行文化または鶏CAMで5日間栽培され、CD-31とHoechstで染色されたマウス胚性腎臓の極性部分を示す。糸球体血管系は、対照培養よりも鶏CAMで培養された腎臓でより成熟している。図Fは、トランスジェニックGFP鶏のCAM上で7日間培養したマウス胚性腎臓を示す。
マウス内皮細胞はCD-31抗体で染色されており、異種移植マウス腎臓の血管構造はほとんどが、マウス由来ではないことが観察できる。新しい固定セット方向培養は、制限された設定距離で胚性腎臓およびオルガノイドの培養を可能にする。伝統的な旅行文化では、培養された器官は金属グリッドによって空気媒体の界面に保たされるフィルターの上に置かれる。
この方法は、開発と成長のための良好な条件を可能にしますが、イメージングには最適ではありません。固定セット方向培養では、培養された器官は、皿のガラス底部と膜の間に押し込まれ、その厚さはスペーサーとして働くポリスチレンビーズによって制御される。現像器官は、カバーガラスを通して、器官の改善された眺めを与える右のイメージを与えることができる。
この図パネルは、胚性腎臓および腎臓オルガノイドを固定セット方向培養方法で培養できることを示す。7日目の胚性腎臓と腎臓オルガノイドの明るいフィールド画像は、正常な発達を示す。図Cにおいて、GFB発現は、図Dによって腎臓オルガノイドの発症ニーフロンにおいて活性化されており、腎芽に1染色された外傷を有する腎臓と、ネフロン前駆細胞を示す6つの2つの染色を示す。
図E及びFは、12日間培養したマウス腎臓を提示する。外傷1とネフロン染色は、ユーレスリック芽およびポドサイトを示す。映画もまた、台湾のクリーが内皮細胞にGFB発現を誘導するMTMG、台湾のクリー起源の胚性腎臓を提示する。
腎内皮細胞が発達中の胚性腎臓に存在し、内皮ネットワークも培養法で発達する可能性があることがわかります。右側のパネルでは、内皮細胞がS字型ステージニーフロンの血管裂け目に移行する様子を見ることができます。ここでは、鶏CAMへの腎オルガノイドおよび胚性腎臓の異種移植のための改善されたプロトコルを提示しました。
このプロトコルは、腎臓の初歩およびそれらの内皮細胞の生存を著しく増加させる。この方法は、発達中の糸球体への血流を可能にする。ここで提示されるもう一つのプロトコルは、イメージングの質を向上させ、単一細胞レベルでのオルガネラの起源を研究するのに役立つ固定された方向の臓器培養法です。
高解像度画像は、自動細胞セグメンテーションや腎オルガノイドおよび腎臓培養における細胞行動のコンピュータベースの研究に適しています。
