프로그램된 줄기 세포에서 파생되는 신장 기관 배양 및 세포기관은 신장 발달과 질병 뒤에 기계장치를 공부하는 훌륭한 방법을 제공합니다. 현재 장기 배양 시스템은 신장에 혈류를 제공하지 않습니다, 그러나. 이 때문에, 현재 모델은 불완전하고 혈액 여과인 신장의 주요 기능을 다시 수피하지 못하는 이유.
이 간행물에서는, 우리는 닭 태아의 chorioallantoic 막에 배아 신장 및 오르가노이드의 재배 그리고 가시화를 위한 향상한 프로토콜을 제시합니다. 우리의 새로운 실험 설정에서, 우리는 문화 매체로 채워진 투과성 의미 저수지와 CAM에 이식 신장 기초를 오버레이. 이 프로토콜은 신장 기초의 생존과 또한 본질적인 내피 세포의 생존을 현저하게 증가시킵니다.
이 방법은 개발 사구체에 혈액 흐름을 가능하게. 최근에는 고해상도 공초점 3D 타임랩스 이미징을 제공하는 새로운 고정 설정 방향 장기 배양 방법도 발표했습니다. 이 방법은 오르가노이드와 장기 기초의 장기 공초점 화상 진찰을 위한 최적 조건을 제공했습니다.
접근에서, 우리는 유리 덮개 전표와 투과성 막 사이 조직을 부드럽게 압축합니다. 여기에서는 맞춤 설계된 플레이트가 어떻게 만들어지는지, 문화 실험이 어떻게 설정되는지 보여줍니다. 따라서, 이 출판물에서 우리는 향상된 신장 세포기관 튜브 문화 기술을 제시합니다.
이 방법은 세포기관 기원을 모델링하고 배아 신장과 신장 오르가노이드 ex vivo를 연구하기 위해 고해상도 이미징을 수행하는 더 나은 방법을 제공합니다. 실험에 따라 6웰 또는 12웰 플레이트용으로 설계된 전송 셀 콘트라 인서트를 복용합니다. 드레멜 도구를 사용하여 인서트 측면을 잘라 투과성 멤브레인이 부착된 2mm 높이의 플라스틱 링을 만듭니다.
메스나 날카로운 칼로 스와프에서 링의 가장자리를 연마합니다. 미니 저수지를 70% 에탄올로 최소 한 시간 동안 살균합니다. 그런 다음 증류수로 오토클레이브로 미니 저수지를 씻고 라미나르 후드로 말리십시오.
PBS 및 문화 매체에서 미니 저장소를 헹구는 것입니다. 저수지를 배양 매체 한 방울 위에 놓고 멤브레인이 위쪽으로 향합니다. 해부된 전 생체 배아 신장 또는 신장 오르간로이드를 막에 배치합니다.
샘플 주위에 많은 액체를 두지 말고 세포 배양 인큐베이터에서 2 시간에서 24 시간까지 부착하십시오. 각종 이식은 8일 된 전 오보 배아 닭의 초라알란토아막에 수행된다. 멤브레인이 접목을 덮을 수 있도록 미니 저장소를 이송합니다.
그들은 배아를 커버하지 않도록 CAM의 주변에 배치. 그런 다음 미니 저장소에 배양 매체를 추가합니다. 최대 9 일 동안 치킨 CAM에 샘플을 재배.
매일 미니 저수지의 배양 매체를 교체하십시오. 시료의 혈관화는 이식 후 이미 24~48시간 후에 관찰될 수 있다. 고정 된 문화에 대한 사용자 정의 디자인 된 6 웰 플레이트를 만들 수 있습니다.
적절한 드릴 비트가 있는 드릴 머신을 사용하여 플레이트 바닥에 20mm 구멍을 뚫는 것으로 시작해야 합니다. 다음으로 플레이트 의 상부에 있는 구멍의 테두리를 연마합니다. 마지막으로, 플레이트를 70% 에탄올로 적어도 한 시간 동안 살균합니다.
그런 다음 증류수로 오토클레이브로 접시를 씻고 레미어 후드로 말립니다. 22x22 밀리미터 커버 슬립을 70% 에탄올로 세척하고 완전히 건조시다. 조직 접착제를 사용하여 우물 의 바닥에 구멍 의 상단에 커버 슬립을 접착제.
건조 후, 멸균 현미경으로 플레이트를 검사하고 과도한 접착제를 제거합니다. 첫째, 폴리스티렌 구슬의 알리쿼트와 동일한 양의 수소를 섞는다. 막이 위를 향하고 멤브레인을 향하고 있는 해부 현미경 아래에 트랜스필 삽입서를 놓고 멤브레인에 신장을 정렬합니다.
신장 다음에 하이드로 젤 비드 혼합물 한 방울을 조심스럽게 넣습니다. 막과 신장이 아래로 향하고 있도록 트랜스필 삽입을 뒤집습니다. 그런 다음 신중하게 사용자 정의 디자인 6 웰 플레이트의 우리의 우물에 삽입을 배치합니다.
삽입을 우물에 매우 부드럽게 밀어 넣습니다. 신장이 구슬과 수준에 있을 때까지 현미경에서 평탄화의 정도를 따르십시오. 한 손으로 우물에 약간 눌러 인서트를 유지하고 납땜 철로 인서트 주변의 3 점에서 플라스틱을 녹여 접시에 고정하십시오.
측면에 있는 개구부를 통해 2밀리리터 배양 배지를 웰에 넣습니다. 시간 경과 이미징을 시작할 때 플레이트를 반전 된 현미경의 무대 인큐베이터로 옮기습니다. 당사의 수정된 CAM 포획 프로토콜은 신장 오르가노이드와 배아 신장의 고효율 혈관화를 가능하게 합니다.
배양 배지를 함유한 많은 저수지는 기증자 조직을 공급하고 혈관을 진행하는 초기 기간 동안 건조로부터 보호합니다. 이 영화는 닭 CAM에 이식하고 7 일 동안 배양 배아 마우스 신장 센터에서 닭 혈구의 흐름을 보여줍니다. 이 그림 패널은 우리의 향상된 CAM 배양 방법이 신장 유래 내피 세포에 대한 허용 조건을 제공한다는 것을 보여줍니다.
피규어 A와 B는 5일 간격 배양시 5일 동안 자라나는 배아 신장을 5일 동안 닭캠에 접목시켰다. 마우스 특이성 CD-31 항체를 염색하는 것은 CAM에 접목된 신장 센터의 내피 세포 네트워크가 좌측 대조군보다 더 광범위하다는 것을 보여준다. 그림 C에서 우리는 마우스 특정 CD-31 항체로 염색된 마우스 혈관이 닭 혈관으로 가장 많은 것을 봅습니다.
피규어 D와 E는 5일 동안 여행 문화 또는 치킨 CAM에서 자라서 CD-31및 Hoechst로 염색된 마우스 배아 신장의 극저섹션을 보여줍니다. 사구질리 혈관은 제어 배양에서보다 닭 CAM에서 배양 신장에서 더 성숙합니다. 도F는 7일 동안 형질전환 GFP 닭의 CAM에서 배양된 마우스 배아 신장을 나타낸다.
마우스 내피 세포는 CD-31 항체로 염색되고 우리는 xeno 이식 마우스 신장에 있는 혈관이 주로 그러나 독점적으로 파생되지 않다는 것을 관찰할 수 있습니다. 새로운 고정 설정 방향 문화는 제한된 설정 거리에서 배아 신장과 오르가노이드의 배양을 배양 할 수 있습니다. 전통적인 여행 문화에서 배양 된 장기는 금속 그리드에 의해 공기 중간 인터페이스에 보관되는 필터에 배치됩니다.
이 방법은 개발 및 성장에 좋은 조건을 허용하지만 이미징에 최적이 아닙니다. 고정 된 설정 방향 문화에서, 배양 기관은 접시의 유리 바닥과 멤브레인 사이에 압착되고 그 두께는 여기에 스페이서로 작동하는 폴리스티렌 구슬에 의해 제어된다. 개발 기관은 기관의 향상된 보기를 주는 커버 유리를 통해 바로 이미지될 수 있습니다.
이 그림 패널은 배아 신장과 신장 오르가노이드가 고정 된 방향 배양 방법으로 배양 될 수 있음을 보여줍니다. 배아 신장과 신장 오르가노이드의 밝은 필드 이미지는 7 일째에 정상적인 발달을 보여줍니다. 도 C에서, GFB 발현은 신장 오르가노이드의 발달 네프론에서 활성화되어 있으며, 신장 싹에 염색한 외상1개와 네프론 전구세포를 표시하는 6개의 2개의 염색이 있는 신장을 나타낸다.
수치는 E와 F가 12일 동안 배양된 마우스 신장을 제시한다. 외상 하나와 nephron 염색은 유망싹과 podocites를 보여줍니다. 영화도 대만 크리가 내피 세포에서 GFB 발현을 유도하는 대만 크리 기원 MTMG의 배아 신장을 제시합니다.
우리는 신장 내피 세포가 발전하는 배아 신장에서 존재하고 내피 망도 배양 방법에서 발전할 수 있다는 것을 알 수 있다. 오른쪽 패널에서 내피 세포가 S 자형 단계 nephron의 혈관 갈라진으로 이동하는 방법을 볼 수 있습니다. 여기에서 우리는 닭 CAM에 신장 오르가노이드와 배아 신장의 xeno 이식을 위한 향상된 프로토콜을 제출했습니다.
이 프로토콜은 신장 기초의 생존과 또한 그들의 본질적인 내피 세포의 생존을 현저하게 증가시킵니다. 이 방법은 개발 사구체에 혈액 흐름을 가능하게. 여기에 제시된 그밖 프로토콜은 화상 진찰 질을 향상하고 단 하나 세포 수준에서 세포구 창세기를 공부하는 것을 돕는 고정된 설정된 방향 기관 배양 방법입니다.
고해상도 이미지는 신장 오르가노이드 및 신장 배양에서 세포 행동의 자동화 된 세포 세분화 및 컴퓨터 기반 연구에 적합합니다.
